一种溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种双光子荧光探针，具体地说是一种溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针及其制备方法和用途。

二、

背景技术：

黏度是细胞中液质流动过程中的重要影响因素，同时，它作为生物体系微环境中的一个重要的性质，影响着物质的传输以及生物分子的相互作用。不正常的黏度变化与生物体系中多种疾病或生理过程有紧密的联系。因此，如何检测细胞中的黏度对生物体系有很重要的意义，这方面的研究也已经引起了很多科学家们的兴趣。

荧光探针作为一种检测工具有很多的优点，比如：灵敏度高，操作方便，廉价易得等等。检测对象与荧光探针作用能够引起荧光信号的响应变化，从而检测出检测对象的变化。

萘二甲酰亚胺作为一种典型的荧光团，不仅具有优良的荧光光谱性质，而且水溶性好，并且细胞毒性低。以萘二甲酰亚胺作为荧光团的单光子荧光探针已经被很多文献所报道，但是作为双光子荧光探针的文献报道还很少。检测细胞溶酶体黏度的双光子荧光探针的报道就更少了。

目前，大部分检测细胞黏度的荧光探针仍为单光子的荧光探针，然而单光子荧光探针具有不少的缺点，如：自荧光干扰很大，激发波长小导致对细胞的光毒性大，容易发生荧光自淬灭等等。双光子荧光探针具有很多单光子荧光探针所不具有的优点，如：细胞光毒性小，不会引起荧光自淬灭，时间空间分辨率高，组织渗透深度大，因而双光子荧光探针已经作为科学家们研究的一个重要课题。

三、

技术实现要素：

本发明旨在提供一种溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计遴选出一种合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞溶酶体黏度，细胞毒性实验表明本发明对细胞几乎没有毒副作用。

本发明溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针(Lyso-NP)，简称为荧光探针，是以萘二甲酰亚胺为母体，其结构式如下：

本发明溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

将化合物1(3.89g)、1，4-二甲胺基苯乙炔(1.74g)、三苯基膦二氯化钯(0.1g)、碘化亚铜(0.5g)加入到反应器中，然后加入三乙胺(3.66g)和N-甲基吡咯烷酮(20ml)，升温至80℃反应12h；反应结束后过滤，滤液蒸发干燥得粗产物，再用柱层析色谱柱分离(以乙酸乙酯/石油醚＝1/2作为洗脱液，v/v)，得到目标产物3.64g(8.03mmol)，收率80％。

所述化合物1的结构式为：

本发明溶酶体靶向的双光子荧光黏度探针Lyso-NP的合成过程如下：

本发明溶酶体靶向的双光子黏度荧光探针在定性检测细胞中黏度时作为检测试剂应用。

将本发明荧光探针溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的该母液于10mL容量瓶中，再用待测溶液定容，配制成10μM。荧光探针单光子和双光子的激发波长分别为460nm和920nm，检测500-750nm波长范围内的荧光光谱变化。

本发明荧光探针检测黏度的机理是荧光探针分子中的萘二甲酰亚胺与1，4-二甲胺基苯乙炔的C-C单键的旋转，黏度小的体系中，C-C单键的旋转所消耗的能量多，分子受激发到激发态后，能量耗散的方式主要为C-C单键旋转；黏度大的体系中，C-C单键的旋转受到抑制，分子受激发到激发态后，能量耗散的方式主要为荧光发射，在530nm处荧光发射峰随着体系黏度增大逐渐增强。这样设计的目的实现了对黏度的检测。

本发明荧光探针在低粘度体系中荧光量子产率较低，在高黏度体系中荧光量子产率升高了8倍左右。因此，本发明荧光探针能更好地应用于生物检测中。

本发明荧光探针能够对生物细胞体系中的溶酶体黏度进行转移性的识别，监测分析以及跟踪。

本发明荧光探针结构简单，合成方便。本发明荧光探针是以荧光强弱来检测黏度的高低。在紫外灯下，肉眼就可以看出其荧光变化，荧光颜色从无变为绿色荧光，操作简便，反应灵敏。本发明荧光探针选择性高，灵敏度高。

四、附图说明

图1是本发明荧光探针Lyso-NP(10μM)在纯甘油和纯水中的紫外吸收光谱。

图2是本发明荧光探针Lyso-NP(10μM)在不同黏度体系中的荧光浓度光谱图，每条线都在静置30min后进行的测试。

图3是本发明荧光探针Lyso-NP(0.5mM)在甘油中在不同的波长激发下双光子吸收截面值。

图4是本发明荧光探针Lyso-NP在MCF-7细胞培养24h后的细胞存活率。从图4中我们可以看出，浓度为20μM时，细胞存活率还有90％左右，说明本发明荧光探针对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞中黏度检测。

图5是本发明荧光探针Lyso-NP在MCF-7细胞中的溶酶体定位成像照片。探针Lyso-NP(10μM)加入到MCF-7细胞中培养30分钟，然后再向其中加入溶酶体染料LysoTracker Red FM(0.5μM)，继续培养10分钟。其中图(a)绿色通道(510-560nm)，λex＝960nm；(b)红色通道(580-620nm)，λex＝599nm；(c)是(a)和(b)通道的叠加图；(d)MCF-7细胞中选取的截面荧光强度分析，绿线表示探针Lyso-NP的荧光强度，红线表示溶酶体染料LysoTracker Red FM的荧光强度。

图6是本发明荧光探针的双光子共聚焦成像照片，其中图a是荧光探针(10μM)在MCF-7细胞中培养30min后，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，在双光子荧光共聚焦显微镜下成像，在960nm激发下，荧光发射收集范围510-560nm；图b是MCF-7细胞的明场；图c是图a和图b的叠加图。

五、具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：荧光探针分子Lyso-NP的合成

将化合物1(3.89g)、1，4-二甲胺基苯乙炔(1.74g)、三苯基膦二氯化钯(0.1g)和碘化亚铜(0.5g)加入到反应器中，然后加入三乙胺(3.66g)和N-甲基吡咯烷酮(20ml)，升温至80^℃反应12h；反应结束后过滤，将滤液蒸发干燥得粗产物，再用柱层析色谱柱分离(以乙酸乙酯/石油醚＝1/2作为洗脱液，v/v)，得到目标产物3.64g(8.03mmol)，收率80％。

所述化合物1的结构式为：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.76(d,J＝8.3Hz,1H),8.62(d,J＝7.1Hz,1H),8.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.88(d,J＝7.7Hz,1H),7.81(t,J＝7.8Hz,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H),6.71(d,J＝8.8Hz,2H),4.38(t,J＝6.9Hz,2H),3.73(s,4H),3.05(s,6H),2.78(s,2H),2.72–2.61(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ164.23,163.94,150.83,133.32,132.86,131.55,131.46,130.67,129.82,129.11,128.26,127.08,120.83,111.78,108.52,101.91,85.25,66.78,56.10,53.69,40.15,29.71.

实施例2：荧光探针分子的荧光测试及双光子测试

将本发明荧光探针溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同体积比的甘油/水混合溶液(甘油与水的体积比分别为50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、99:1)定容，配制成10μM。荧光探针单光子和双光子的激发波长分别为460nm和960nm，检测500-750nm波长范围内的荧光光谱变化。

利用双光子测试技术，测试荧光探针(Lyso-NP)在不同黏度体系中的双光子吸收截面，从图3可以看出，荧光探针分子在甘油中的最大双光子吸收截面为650GM，双光子激发波长在960nm。

实施例3：细胞毒性测试

MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)实验是根据已报道的文章，做一些细胞毒性测试。分别在同一批细胞中加入0，5，10，15，20，25μM的荧光探针，此条件是在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式：细胞存活率％＝OD570(样品)/OD570(对照组)×100，可算得细胞存活率(图4)。从图4中我们可以看出，浓度为20μM时，细胞存活率还有90％左右，说明了本发明荧光探针对细胞无毒性作用，因此可以用来检测细胞中的黏度。

实施例4：细胞定位测试

MCF-7细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，MCF-7细胞放于激光共聚焦皿中，成像时MCF-7细胞和10μM的荧光探针Lyso-NP的DMSO溶液于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次后，再往培养皿中加入0.5μM商品化溶酶体染色剂LysoTracker Red FM溶液继续孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液洗涤3次。用双光子荧光共聚焦成像，设置绿色通道tracker1，激发波长为960nm，发射波段为510-560nm，这个通道用来接受探针分子Lyso-NP发射的荧光。设置红色通道tracker2，激发波长为577nm，发射波长为580-600nm，这个通道用来接收商品化溶酶体染色剂LysoTracker Red FM发射的荧光(图5)。

实施例5：细胞成像测试

MCF-7细胞由DEME(invitrogen)培养液培养，成像前一天，MCF-7细胞放于平底表面皿中，成像时MCF-7细胞和10μM的荧光探针Lyso-NP的DMSO溶液于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用中性的PBS缓冲溶液或培养液充分洗涤后，用双光子荧光共聚焦成像，得图6。