一种运送DNA的非病毒载体、制备方法及应用与流程

本发明属于非病毒载体制备技术领域，具体涉及一种运送DNA的非病毒载体、制备方法及应用。

背景技术：

利用导入外源基因作为修复缺陷基因的一种治疗手段，近年来越来越受到科学家的青睐。为各种获得性或先天性疾病的治疗提供了一个很有前景的技术，如癌症、肝炎、囊性纤维化、和镰刀形细胞性贫血等。尽管基因治疗有着显著地影响和重要的意义，但是如何安全高效的传递基因成为了该技术成败的关键。大量的病毒性载体已被开发应用于基因递送，并且已经证明病毒性载体作为基因递送的工具具有极高的转染效率，但同时由其本身潜在的致癌性和免疫原性等带来的安全问题不容忽视，使得病毒性载体在基础研究及临床应用中的使用受到了极大限制。因此，各种各样的非病毒性载体随之被开发利用。

实际应用中非病毒性载体也受到了显著细胞毒性和转染效率低下的限制，基于此类问题，开发高效低毒的基因载体是当前非病毒基因治疗领域的迫切需要。

技术实现要素：

本发明提供的一种运送DNA的非病毒载体、制备方法及应用，解决了现有技术中非病毒性载体细胞毒性高、转染效率低下的问题。

本发明提供了一种运送DNA的非病毒载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将L-色氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和超纯水按照30～35mg：200～220mg：0.5～2ml：7～9ml的比例混合均匀，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液在室温下孵育8～10h，得到孵育混合物溶液；

步骤3，将孵育混合物溶液以5000g离心5～10min，收集上清液；

步骤4，将步骤3收集的上清液置于截留分子量为3500Da的透析袋内，加入超纯水，透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到运送DNA的非病毒载体。

优选的，上述运送DNA的非病毒载体的制备方法中，步骤1中L-色氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和超纯水的比例为30mg：200mg：1ml：8.5ml。

优选的，上述运送DNA的非病毒载体的制备方法中，步骤2的孵育时间为8h。

优选的，上述运送DNA的非病毒载体的制备方法中，步骤3的离心时间为5min。

优选的，上述运送DNA的非病毒载体的制备方法中，步骤4中，所述真空冷冻干燥的温度为-20～-50℃、真空度为5～10Pa。

本发明还提供了一种根据上述制备方法制备而成的运送DNA的非病毒载体。

本发明还提供了一种上述运送DNA的非病毒载体在向细胞内部输送外源基因的应用。

与现有技术相比，本发明的运送DNA的非病毒载体具有以下有益效果：

1、本发明提供的一种运送DNA的非病毒载体的制备方法简单、高效且对细胞无害。

2、本发明的方法制备而成的运送DNA的细胞毒性很低，具有较强的DNA结合力，良好生物相容性，有效地屏蔽了质粒的负电荷，从而成功被细胞内吞，具有较高转染效率，在对细胞无害的前提下，成功将外源基因输送到细胞内部并成功表达目的蛋白，可以用作非病毒载体，在向细胞内部输送外源基因方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为非病毒载体在扫描电镜下的整体形貌图；

图2为非病毒载体与DNA结合后在扫描电镜下的整体形貌图；

图3为将携带有GFP基因非病毒载体运送至酵母细胞中后，GFP蛋白的荧光显微视图；

图4为将携带有GFP基因非病毒载体运送至酵母细胞中后酵母细胞的显微视图；

图5为非病毒载体对大肠杆菌生长状况的影响；

图6为非病毒载体的电位分布图；

图7为运送目的DNA的电位分布图；

图8为非病毒载体与酵母DNA结合后的电位分布图；

图9为将GFP质粒转入酵母细胞表达后酵母细胞的形态图；

图10为通过非病毒载体递送GFP质粒到酵母细胞中表达后酵母细胞的形态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明提供的一种运送DNA的非病毒载体，包括以下实施例：

实施例1

一种运送DNA的非病毒载体，具体按照以下步骤制备：

步骤1，将L-色氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和超纯水按照30mg：200mg：1ml：8.5ml的比例混合均匀，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液在室温下孵育8h，得到孵育混合物溶液；

步骤3，将孵育混合物溶液以5000g离心5min，收集上清液；

步骤4，将步骤3收集的上清液置于透析袋内，加入超纯水，透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到运送DNA的非病毒载体，4℃保存，其中，所述透析袋的截留分子量为3500Da，压平后的宽度为3.4cm，注满水时形成的圆柱状的直径为2.2cm。

实施例2

一种运送DNA的非病毒载体，具体按照以下步骤制备：

步骤1，将31mg L-色氨酸、205mg牛血清蛋白、1.5ml氯金酸和8ml超纯水混合均匀，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液在室温下孵育8h，得到孵育混合物溶液；

步骤3，将孵育混合物溶液以5000g离心5min，收集上清液；

步骤4，将步骤3收集的上清液置于透析袋内，加入超纯水，透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到运送DNA的非病毒载体，该非病毒载体为粉末状态，4℃保存，其中，所述透析袋的截留分子量为3500Da，压平后的宽度为3.4cm，注满水时形成的圆柱状的直径为2.2cm。

实施例3

一种运送DNA的非病毒载体，具体按照以下步骤制备：

步骤1，将35mg L-色氨酸、220mg牛血清蛋白、2ml氯金酸和9ml超纯水混合均匀，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液在室温下孵育10h，得到孵育混合物溶液；

步骤3，将孵育混合物溶液以5000g离心10min，收集上清液；

步骤4，将步骤3收集的上清液置于透析袋内，加入超纯水，透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到运送DNA的非病毒载体，该非病毒载体为粉末状态，4℃保存，其中，所述透析袋的截留分子量为3500Da，压平后的宽度为3.4cm，注满水时形成的圆柱状的直径为2.2cm。

实施例4

一种运送DNA的非病毒载体，具体按照以下步骤制备：

步骤1，将33mg L-色氨酸、210mg牛血清蛋白、0.5ml氯金酸和7ml超纯水混合均匀，得到原料混合物溶液；

步骤2，将所述原料混合物溶液在室温下孵育9h，得到孵育混合物溶液；

步骤3，将孵育混合物溶液以5000g离心7min，收集上清液；

步骤4，将步骤3收集的上清液置于透析袋内，加入超纯水，透析24h，然后将透析袋内的溶液经真空冷冻干燥，得到运送DNA的非病毒载体，该非病毒载体为粉末状态，4℃保存，其中，所述透析袋的截留分子量为3500Da，压平后的宽度为3.4cm，注满水时形成的圆柱状的直径为2.2cm。

需要说明的是，上述本发明的制备方法及实施例1-4中，制备的非病毒载体可以直接将液体于4℃保存半年，或者冻干成粉末后-20℃长期保存。

我们利用含有GFP荧光蛋白基因的质粒与本发明运送DNA的非病毒载体相结合，然后以酵母细胞作为运送对象，并诱导酵母细胞的表达，具体步骤如下：

将5μg冻干的运送DNA的非病毒载体溶于500μl超纯水中，加入4μg含有GFP荧光蛋白基因的质粒，再加入500μl的超纯水，以此比例调整体系大小，置于旋转摇床孵育大约10h。

通过激光共聚焦显微镜观察检测表达结果，结果如图1-2所示，图1为非病毒载体在扫描电镜下的整体形貌图，图2为非病毒载体与DNA结合后在扫描电镜下的整体形貌图；比较图1和图2的形貌图，比较图1和图2，非病毒载体本身为80nm左右的类方块形，当而当载体与DNA结合后形貌上由方形变为不规则团簇形状，尺寸上也变的更大，约400～500nm。由此可知，非病毒载体与DNA之间存在良好的组装过程。

同时，我们在激光共聚焦显微镜下观察了转入GFP荧光蛋白基因的酵母细胞，结果如图3-4所示，图3为将携带有GFP基因非病毒载体运送至酵母细胞中后，GFP蛋白的荧光显微视图，可看到明显的绿色荧光，说明GFP蛋白已成功在酵母细胞中表达；图4为将携带有GFP基因非病毒载体运送至酵母细胞中后酵母细胞的显微视图，酵母细胞形态规则，细胞活性良好，说明该运送DNA的非病毒载体具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性。

另外，为了进一步说明本发明非病毒载体具有较低的毒性，我们利用大肠杆菌细胞作为实验对象，在5ml LB培养基中孵育大肠杆菌细胞，细胞分为两组，实验组的细胞中加入500微升非病毒载体，空白对照组的细胞不做任何处理。通过监测两组细胞的生长OD₆₀₀值来观察非病毒载体对细胞的毒性情况。结果如图5所示，图5为非病毒载体对大肠杆菌生长状况的影响，实验组(实心)与对照组(空心)中的数据显示非病毒载体对细胞的生长没有影响，即非病毒载体的细胞毒性几乎为零。

为了进一步说明本发明非病毒载体具有良好的生物相容性，可以成功屏蔽质粒的负电荷，我们分别对非病毒载体、酵母DNA和非病毒载体结合酵母DNA后的样品进行ZeTa电位测试。图6为非病毒载体的电位分布图，图7为运送目的DNA的电位分布图，图8为非病毒载体与酵母DNA结合后的电位分布图。结果显示非病毒载体结合酵母DNA后，所带负电荷显著降低，说明该非病毒载体具有良好的生物相容性。

为了进一步说明本发明非病毒载体具有较高的转染效率，我们以酵母细胞为研究对象，分别利用常规生物转染法将GFP质粒转入酵母细胞；然后利用非病毒载体将GFP质粒运送到酵母细胞中，观察表达结果，结果如图9-10所示，图9为将GFP质粒转入酵母细胞表达后酵母细胞的形态图，图10为通过非病毒载体递送GFP质粒到酵母细胞中表达后酵母细胞的形态图，比较图9-10我们可以看出，两种方法下，GFP质粒均能在酵母细胞中成功表达，且结果相同，说明非病毒载体具有较高的转染效率。另外，本发明非病毒载体将GFP质粒运送到酵母细胞中的步骤更简单，成本更低，具有良好的应用前景。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。