本发明属于药物化学领域，具体涉及嘧啶并三氮唑类的化合物、它们的制备方法及其在以组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶(以下简称lsd1)为靶标抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：：肿瘤是严重危害人类健康而又难以克服的疾病，目前已经上市的抗肿瘤药物也有很多，但这些药物中还是存在一些问题，比如毒性大、靶向性弱以及容易产生耐药性等。因此，新型抗肿瘤药物的研发显得尤为重要。组蛋白共价修饰是一种重要的表观遗传模式，包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化以及泛素化等，其中乙酰化与甲基化是针对组蛋白修饰机制研究中比较多的组蛋白修饰方式。2004年以前组蛋白甲基化被认为是不可逆的，赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶(lysinespecificdemethylase1，lsd1)是第一个被发现的可以催化组蛋白h3k4me1/2和h3k9me1/2去甲基化的特异性去甲基化酶，从而调节下游靶基因的转录。lsd1在多种肿瘤细胞中的表达量显著高于正常细胞，如神经母细胞瘤、眼癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等。而实验证明，通过rnai技术或小分子抑制剂在细胞水平降低lsd1表达量或降低lsd1的活性能抑制细胞增殖并诱导一些细胞分化相关基因的表达；在小分子单胺氧化酶抑制剂pcpa的作用下亦能抑制多种肿瘤细胞和实体瘤的生长。因此，lsd1抑制剂不仅能作为表观遗传学的研究工具用于阐述生物学功能，而且能作为表观遗传学药物用于肿瘤的预防和治疗，已经引起科研界的广泛关注，成为当前研究的热点。同时，嘧啶类及三氮唑杂环类化合物具有非常广泛的生物活性，例如抗病毒、抗菌、抗炎以及抗肿瘤等。但是将嘧啶与三氮唑结构结合的新的化合物与基于lsd1靶点的抗肿瘤作用结合到一起研究的报道较少，因此此类研究具有非常重要的价值。技术实现要素：为开发利用现有的临床药物资源，本发明目的在于提供一类以嘧啶并三氮唑为母核的衍生物，从而为寻找一类新的基于lsd1靶点的抗肿瘤药物开辟一条新途径；本发明另一目的在于提供其制备方法及其在制备抗肿瘤药物和lsd1抑制剂中的应用。为实现本发明目的，本发明所述的嘧啶并三氮唑类lsd1抑制剂的结构通式如下：通式i中r2为c1-5直链烷基，c1-5支链烷基或者c3-5环烷基，中的任意一个，其中，r为卤素，h，-oh，-no2，-och3，c1-4酰基，n＝1～6；mso-为甲基磺酸基，tso-为甲苯磺酸基；r1为以下几个基团中的任意一个：c1-5直链烷基，c1-5支链烷基或者c3-5环烷基，氢原子，其中，x为氮，氧或者硫原子，r为卤素，h，-oh，-no2，-och3，c1-4酰基，n＝1～6；r3为以下基团的任意一个：其中，r为卤素，h，-oh，-no2，-och3，cf3，c1-4烷基或c1-4酰基。通式i中优选：r2为c1-5直链烷基，c1-5支链烷基或者c3-5环烷基，中的任意一个；n＝1～3；r1为以下几个基团中的任意一个：c1-5直链烷基，c1-5支链烷基或者c3-5环烷基，氢原子，其中，x为硫原子，n＝1～3；r3为以下基团的任意一个：其中，r为c1-4烷基，氯，溴，h。更优选以下化合物之一：8:r1＝propyl-s-,9:r1＝propyl-s-,10:r1＝propyl-s-,11:r1＝propyl-s-,12:r1＝propyl-s-,13:r1＝propyl-s-,14:r1＝propyl-s-,15:r1＝propyl-s-,16:r1＝propyl-s-,17:r1＝propyl-s-,18:r1＝propyl-s-,19:r1＝propyl-s-,20:r1＝propyl-s-,21:r1＝propyl-s-,本发明所述嘧啶并三氮唑类lsd1抑制剂的制备方法，主要通过以下步骤制得：1.通式2的制备方法：溶剂中，将化合物1和溴代烃，在碱性物质作用下，室温下搅拌反应，反应结束后，过滤，洗涤，干燥，得系列化合物2。本反应中，所用溶剂可以是丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈、水、dmf、二氯甲烷、氯仿、二氧六环中之一或者两种以上的混合物。所用的碱性物质可以是三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种。所述溴代烃对应通式中r1取代基；2.通式3的制备方法：在醋酸中，加入硝化试剂，然后分批加入系列化合物2，搅拌反应，反应结束后，倒入水中，抽滤，洗涤，干燥，得系列化合物3。本反应中，所述硝化试剂选发烟硝酸，浓硝酸。优选温度15-60℃。3.通式4的制备方法：溶剂中，加入氯化试剂，然后分批加入系列化合物3，滴加有机碱，回流反应，反应结束后，冷至室温，水解，用有机溶剂萃取，水洗，中和，干燥有机相即得系列化合物4粗品(不经进一步优化可以直接进行下一步，纯品可以经用柱层析制得)。本反应中，所述氯化试剂可以是三氯氧磷，五氯化磷，溶剂可以是甲苯，二氧六环，thf，乙酸乙酯等，所述有机碱可以是三乙胺、n,n-二甲基苯胺、二甲基乙酰胺(dma)、n，n-二乙基苯胺或吡啶等。优选温度40～120℃。4.通式5的制备方法：将系列化合物4溶于乙醇和醋酸的混合溶剂中，然后分批加入还原铁粉，升温回流反应，抽滤，旋干溶剂，再用有机溶剂萃取，水洗，干燥有机相，得到系列化合物5的粗品，纯品可经柱层析制得。5.通式6的制备方法：将系列化合物5和胺类化合物溶于溶剂中，再加入有机碱，回流反应，反应结束后，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯，水洗，干燥有机相，得到系列化合物6的粗品(不经进一步纯化直接用于下一步反应)。本反应中，反应所用溶剂可以是甲醇，乙醇，异丙醇，dmf，二氧六环，thf，乙腈等，所述有机碱可以是三乙胺，吡啶或二异丙基乙胺等。优选反应温度是60～120℃。所述的胺类化合物对应通式中r2取代基；6.通式7的制备方法：将系列化合物6溶于醋酸和水的混合液中，冰浴下滴加亚硝酸钠的水溶液反应，反应结束后，加入乙酸乙酯和水，分层，水洗，中和，干燥有机相，得系列化合物7粗品，不经进一步纯化直接进行下一步反应。7.通式中化合物8～21的制备方法：将系列化合物7和巯基芳环类化合物溶于溶剂中，加入缚酸剂，室温或回流反应，反应结束后，蒸干溶剂，溶于乙酸乙酯，用水洗，干燥，过柱，流动相为不同比例的石油醚和乙酸乙酯。本反应中，所述溶剂为甲醇，乙醇，异丙醇，thf，乙腈，dmf，二氧六环等，缚酸剂为三乙胺，吡啶，异丙基乙胺等。优选反应温度为20～100℃。本发明所述的嘧啶并三氮唑类衍生物，通过lsd1酶活性实验发现对lsd1有很好的抑制作用。因此，本发明提供的嘧啶并三氮类衍生物为开发新型抗肿瘤药物、药物的联合用药以及新型lsd1抑制剂药物开辟了另一有效途径，此类化合物的合成设计合理，反应条件温和，操作简单，反应收率高，总收率达60％以上，若开发成为新药将有良好的市场应用前景。具体实施方式为了对本发明进行更好的说明，特举实施例如下：实施例1化合物8，r1＝propyl-s-,的制备(1)化合物2(r1＝propyl-s-)的制备将巴比妥酸(3g，1eq)和三乙胺(2.9ml，1eq)加到30ml的甲醇中，加热回流下，缓慢滴加溴丙烷(1.8ml,1eq)，加完后继续回流1小时，冷却，抽滤，得到3.7g粉色固体化合物2b，产率97％。(2)化合物3(r1＝propyl-s-)的制备冰浴下，将3ml的发烟硝酸小心溶于6ml的醋酸中，然后分批加入2.9g化合物2b，加完后，继续搅拌2小时，然后将反应液加到18ml的冰水中，抽滤，水洗，得到暗红色的粉末化合物3b，产率77.5％。(3)化合物4(r1＝propyl-s-)的制备将化合物3b(12.4g，1eq)，溶于50ml的三氯氧磷中，缓慢滴加dma(12ml，1.8eq)，然后升温至回流，反应5小时。冷至室温，水解，然后用ea萃取，水洗，再用饱和的碳酸钠溶液洗涤，有机相干燥后，即得棕色化合物4b粗品13g，产率90.2％。(4)化合物5(r1＝propyl-s-)的制备将化合物4b(0.5g,1eq)溶于4ml的甲醇和2ml的醋酸中，然后分批加入还原铁粉(0.3g,3eq),回流2小时，冷至室温，抽滤，滤液蒸干，溶于乙酸乙酯，用饱和的碳酸钠溶液洗涤，水洗，干燥有机相，蒸干后得0.44g化合物5b粗品，产率95％。(5)化合物6(r1＝propyl-s-，)的制备将化合物5b(3.9g,1eq),乙醇胺(1.0g，1eq)和三乙胺(3ml,1.3eq)溶于乙醇中，回流48小时，蒸干溶剂，溶于乙酸乙酯，然后用稀盐酸中和至中性，水洗三次，干燥，蒸干后得化合物6b粗品，不经进一步纯化，直接进行下一步。(6)化合物7(r1＝propyl-s-，)的制备将上步化合物6的粗品溶于醋酸和水的混合液中，0℃冰浴下，滴加亚硝酸钠(1.13g,1eq)的水溶液，保持温度不超于10℃，然后继续搅拌反应1小时，将反应液溶于乙酸乙酯中，用水洗三次，然后再用饱和的碳酸氢钠溶液中和至中性，水洗，干燥有机相，蒸干后得到化合物7b粗品，不经纯化直接进行下一步。(7)化合物8的制备将中间体化合物7b(100mg,1eq)、巯基苯并噻唑(61mg,1eq)和三乙胺(37mg,1eq)溶于乙醇中，加热至回流数小时，用tlc(pe/ea)监测反应，结束后蒸干溶剂，溶于乙酸乙酯，水洗，干燥，过柱，得白色固体89mg，产率60％。1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ8.23-8.25(d,j＝7.6hz,1h),8.10-8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.55-7.63(m,2h),4.95-4.97(t,j＝5.8hz,1h),4.64-4.67(t,j＝5.4hz,2h),3.92-3.96(m,2h),2.95-2.99(t,j＝7.0hz,2h),1.48-1.57(m,2h),0.77-0.80(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.45,159.12,155.22,152.07,149.55,137.35,131.15,127.31,126.72,123.39,122.66,59.26,50.35,33.09,22.33,13.44.。实施例2化合物9，r1＝propyl-s-,的制备甲磺酰氯保护的羟基乙胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备9.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.12-8.14(d,j＝8.0hz,1h),7.97-7.99(d,j＝7.6hz,1h),7.55-7.59(m,1h),7.49-7.53(m,1h),4.95-4.97(t,j＝5.2hz,2h),4.79-4.81(t,j＝5.2hz,2h),3.00(s,3h),1.57-1.62(m,2h),0.85-0.89(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ171.34,160.36,154.99,152.17,149.24,137.33,131.06,126.62,126.08,123.47,121.31,65.21,46.06,37.95,33.50,22.17,13.26.。产率70％。实施例3化合物10，r1＝propyl-s-,的制备苯甲酰基保护的羟基乙胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备10.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.11-8.13(d,j＝8.0hz,1h),7.96-7.98(d,j＝7.6hz,1h),7.91-7.94(m,2h),7.54-7.58(m,2h),7.48-7.52(m,1h),7.40-7.44(m,2h),5.02-5.05(t,j＝5.2hz,2h),4.83-4.85(t,j＝5.2hz,2h),2.87-2.90(t,j＝7.2hz,2h),1.50-1.59(m,2h),0.83-0.86(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ171.04,166.04,160.02,155.33,152.08,149.33,137.23,133.37,131.01,129.75,129.20,128.50,126.57,125.99,123.40,121.26,62.34,46.12,33.32,22.12,13.27.。产率63％。实施例4化合物11，r1＝propyl-s-,的制备用甘二醇胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备11.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.08-8.10(d,j＝8.0hz,1h),7.94-7.96(d,j＝8.0hz,1h),7.52-7.56(m,1h),7.45-7.49(m,1h),4.78-4.81(t,j＝5.2hz,2h),4.03-4.06(t,j＝5.2hz,2h),3.65(m,2h),3.58-3.60(t,j＝4.2hz,2h),2.91-2.95(t,j＝7.4hz,2h),1.52-1.58(m,2h),0.80-0.84(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.83,160.15,155.16,152.20,149.21,137.36,131.09,126.58,126.04,123.45,121.28,72.57,68.65,61.61,46.90,33.47,22.19,13.24.。产率65％。实施例5化合物12，r1＝propyl-s-,的制备用对甲苯磺酰基保护的甘二醇胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备12.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.10-8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.95-7.97(d,j＝7.6hz,1h),7.73-7.75(d,j＝8.4hz,2h),7.53-7.57(m,1h),7.46-7.50(m,1h),7.32-7.34(d,j＝8.4hz,2h),4.70-4.73(t,j＝5.6hz,2h),4.05-4.08(t,j＝4.6hz,2h),3.99-4.02(t,j＝5.6hz,2h),3.64-3.66(t,j＝4.6hz,2h),2.96-3.00(t,j＝7.2hz,2h),2.44(s,3h),1.56-1.64(m,2h),1.24-1.28(t,j＝7.2hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.72,159.91,155.39,152.15,149.21,144.94,137.30,131.03,129.88,127.90,126.54,125.97,123.42,121.26,68.88,68.86,68.55,68.41,46.49,33.47,22.21,13.27.。产率72％。实施例6化合物13，r1＝propyl-s-,的制备用糠胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备13.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.08-8.10(d,j＝8.0hz,1h),7.94-7.96(d,j＝8.0hz,1h),7.52-7.56(m,1h),7.46-7.49(m,1h),7.36-7.37(d,j＝1.2hz,1h),6.48-6.49(d,j＝3.2hz,1h),6.35-6.36(m,1h),5.76(s,2h),3.00-3.03(t,j＝7.4hz,2h),1.61-1.66(m,2h),0.89-0.93(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ170.86,159.80,155.56,151.99,148.69,147.10,143.40,137.14,130.94,126.51,125.90,123.33,121.24,110.77,110.26,43.34,33.45,22.24,13.36.。产率61％。实施例7化合物14，r1＝propyl-s-,的制备用异丙胺代替乙醇胺，采取实施例7同样的方法制备14.1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm):δ8.10-8.12(d,j＝8.4hz,1h),7.96-7.98(d,j＝8.0hz,1h),7.53-7.57(m,1h),7.47-7.50(m,1h),5.17-5.23(m,1h),3.01-3.05(t,j＝7.2hz,2h),1.74-1.76(d,j＝6.8hz,6h),1.61-1.70(m,2h),0.90-0.94(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3,ppm):δ169.85,159.59,155.77,151.99,148.24,137.14,131.41,126.50,125.87,123.31,121.24,51.52,33.43,22.28,21.94,13.35.。产率60％。实施例8化合物15，r1＝propyl-s-,的制备用巯基苯并噁唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备15.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ7.92-7.94(d,j＝8.0hz,1h),7.86-7.88(d,j＝8.0hz,1h),7.56-7.60(m,1h),7.50-7.54(m,1h),4.95(br,1h),4.61-4.63(t,j＝5.4hz,2h),3.89-3.93(m,2h),2.76-2.79(t,j＝7.2hz,2h),1.33-1.42(m,2h),0.67-0.71(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.51,160.03,153.67,152.79,149.94,141.77,131.46,127.52,125.78,120.93,111.76,59.23,50.35,33.13,22.10,13.22.。产率66％。实施例9化合物16，r1＝propyl-s-,的制备用巯基嘧啶代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备16.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ8.85-8.86(d,j＝4.8hz,2h),7.58-7.60(t,j＝4.8hz,1h),4.98(br,1h),4.62-4.65(t,j＝5.4hz,2h),3.93-3.94(m,2h),3.02-3.04(t,j＝7.0hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.91-0.95(t,j＝7.2hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.52,165.21,160.78,159.51,149.96,132.73,121.32,59.19,50.28,33.14,22.38,13.63.。产率71％。实施例10化合物17，r1＝propyl-s-,的制备用2-巯基-1,3,4-噻二唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备17.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ9.96(s,1h),4.94-4.97(t,j＝6.0hz,1h),4.65-4.67(t,j＝5.4hz,2h),3.92-3.96(m,2h),3.03-3.07(t,j＝7.2hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.93-0.97(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ169.48,159.38,158.04,155.12,149.59,131.18,59.25,50.38,33.12,22.36,13.63.。产率70％。实施例11化合物18，r1＝propyl-s-,的制备用2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备18.1hnmr(400mhz,dmso-d6,ppm):δ7.79(s,1h),4.90-4.93(t,j＝5.8hz,1h),4.62-4.64(t,j＝5.4hz,2h),3.90-3.94(m,2h),3.03-3.07(t,j＝7.2hz,2h),1.58-1.67(m,2h),0.94-0.97(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,dmso-d6,ppm):δ173.62,168.96,160.34,149.11,138.42,130.82,58.77,49.78,32.78,22.13,13.09.。产率65％。实施例12化合物19，r1＝propyl-s-,的制备用2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备19.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.29(d,j＝1.2hz,1h),7.25(d,j＝1.3hz,1h),4.71-4.73(m,2h),4.17(m,2h),3.73(s,3h),2.89-2.93(m,2h),1.62-1.65(m,2h),0.97-1.00(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.95,167.39,154.15,136.25,136.12,135.73,129.97,64.56,54.53,38.84,38.15,27.01,18.12.。产率69％。实施例13化合物20，r1＝propyl-s-,的制备用2-巯基噻唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备20.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.02(d,j＝3.4hz,1h),7.68(d,j＝3.4hz,1h),4.74-4.77(m,2h),4.17-4.21(m,2h),2.97-3.00(t,j＝6.7hz,2h),1.64-1.69(m,2h),0.98-1.02(t,j＝7.3hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ170.27,160.66,152.04,149.15,143.59,131.03,125.00,59.98,49.91,33.32,22.23,13.37.。产率62％。实施例14化合物21，r1＝propyl-s-,的制备用甲巯咪唑代替巯基苯并噻唑，采取实施例7同样的方法制备21，1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.29(d,j＝1.2hz,1h),7.25(d,j＝1.3hz,1h),4.71-4.73(m,2h),4.17(m,2h),3.73(s,3h),2.89-2.93(d,j＝7.2hz,2h),1.62-1.65(m,2h),0.97-1.00(t,j＝7.4hz,3h).13cnmr(100mhz,cdcl3)δ174.95,167.39,154.15,136.25,136.12,135.73,129.97,64.56,54.53,38.84,38.15,27.01,18.12.。产率68％。实施例15上述化合物的lsd1抑制活性测定：1.实验方法：样品为实施例所合成的上述化合物、纯化而得；样品储备液：称取3-5mg样品置于1.5mlep管中，然后用dmso配制成浓度是20mm的溶液，4℃保存放置，实验时根据所需浓度用dmso稀释。将待测样品与lsd1蛋白于室温孵育后，加入lsd1反应底物h3k4me2并孵育反应，最后加入荧光染料amplex和辣根过氧化酶hrp室温孵育，在酶标仪上激发光530nm，发射光590nm检测荧光数值:试验结果采用spss软件计算ic50值。实验结果如下所示。table1.上述化合物8～21对lsd1的抑制活性数据:当前第1页12当前第1页12