一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种丙型肝炎病毒（HCV）检测试剂盒，特别涉及一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒。

背景技术：

丙型肝炎病毒（(Hepatitis C Virus，HCV）属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA病毒，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型。HCV体呈球形，其直径小于80nm（在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm ）。

HCV感染可引起丙型病毒性肝炎，主要通过输血传播、性传播、生活密切接触传播（如共用剃须刀、牙刷等）。据统计，全球有1.8亿人感染HCV，我国人口的平均感染率为3.2%，有约4千万丙型肝炎病毒携带者。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，HCV感染者有约50%~80%发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化，而肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。丙型肝炎所造成的健康危害和经济损失十分巨大。因此，一种有效、快速、简便的HCV的检测试剂盒对临床HCV辅助诊断均有十分重要的作用。

目前HCV检测方法有ELISA、RIA、测序、实时荧光定量PCR等。其中，ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种试验技术，但其干扰因素较多，重复性不好；灵敏度不够高；容易出现假阳性。RIA是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析技术，但只能以免疫反应测得具有免疫活性的物质，对具有生物活性但失去免疫活性的物质是检测不出来的；使用了生物试剂，其稳定性受多种因素影响，不够稳定；灵敏度不够高；是竞争性的反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，测得的值是相对量而非绝对量；存在放射线辐射和污染。测序是对基因的序列进行判断的一种方法，可以对HCV进行分型检测，但其操作复杂、耗时，且仪器设备昂贵；实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法，其灵敏度高，但需要的仪器设备昂贵，不利于大规模推广应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，主要解决现行技术灵敏度低、操作复杂、耗时、所需仪器设备昂贵等问题。本发明试剂盒不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，仅需在恒温条件下即可进行核酸的扩增。

本发明所采取的技术方案是：一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，包括PCR反应液，PCR反应启动液、PCR反应酶系，HCV的特异性引物及探针，内标18S RNA的特异性引物及探针，阴阳性质控品。其中，所述的HCV特异性引物及探针、内标18S RNA的特异性引物及探针序列如下：

检测HCV的上游引物F1的序列为：

CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC；

检测HCV的下游引物R1的序列为：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC；

检测HCV的荧光探针P1序列为：FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ；

检测内标18SRNA的上游引物F1序列为：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC；

检测内标18SRNA的下游引物R1的序列为：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC；

检测内标18SRNA的荧光探针P1序列为：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应液的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）

Tris-缓冲液 50~100mmol/L

KCl 20~60mmol/L

二硫苏糖醇 2~5mmol/L

甜菜碱 0.5~2mol/L

海藻糖 1%~4%

PEG 2%~5%

BSA 0.1~0.6mg/mL

优选的，Tris-缓冲液可选自Tris-H₂SO₄、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一种或多种，Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应启动液的具体组分如下：

品名 摩尔浓度

Mg²⁺ 8mmol/L~30mmol/L

优选的，Mg²⁺来自于硫酸镁、乙酸镁、氯化镁中的任意一种或多种。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应酶系的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）

dNTPs 180~250μmol/L

聚合酶BSU 120~160ng/μl

单链结合蛋白 200~700ng/μl

重组酶（E.coli RecT） 100~300ng/μl

逆转录酶 0.05~0.9U/μl

聚合酶、单链结合蛋白、重组酶和逆转录酶的用量可以根据需要调整其添加量，或通过预实验确定其用量。

优选的，一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应液的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）

Tris-HCl（pH=9.0） 80mmol/L

KCl 40mmol/L

二硫苏糖醇 3.2mmol/L

甜菜碱 1mol/L

海藻糖 3%

PEG 4%

BSA 0.3mg/mL

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR启动液的具体组分如下：

品名 摩尔浓度

氯化镁 20mmol/L

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应酶系的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）

dNTPs 220μmol/L

聚合酶BSU 140ng/μl

单链结合蛋白 700ng/μl

重组酶（E.coli RecT） 200ng/μl

逆转录酶 0.1U/μl

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的特异性引物及探针序列如下：

HCV-F1：CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC

HCV-R1：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC

HCV-P1：

FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ

18S-F1：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC

18S-R1：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC

18S-P1：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ 。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的阴阳性质控品如下：

品名 成分

阳性质控品 含有18SRNA、HCV假病毒

阴性质控品 DEPC水 。

优选的，一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，其HCV探针连接的荧光基团不同于内标18SRNA探针连接的荧光基团。

优选的，一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒采用的重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

优选的，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。

本发明的有益效果：

①本发明的丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，主要利用重组酶的活性，仅在恒温条件下即可进行核酸的扩增。在多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统荧光PCR技术，且所用时间更短，30min内即可完成。

②本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪（如ABI7500、ABI7300、LC480）。

③本发明还可跟试纸条组合，在未来可走进普通家庭，为实现个人自我诊断提供不可缺的帮助，拥有巨大的潜在市场，其经济价值和社会效益不可估量。

附图说明

图1至图5依次分别为实施例1至实施例5的目的基因的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。

具体实施方式

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括PCR反应液，PCR启动液，PCR反应酶系，HCV特异性引物及探针,内标18S RNA的特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应液的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）

Tris-HCl（pH=9.0） 80mmol/L

KCl 40mmol/L

二硫苏糖醇 3.2mmol/L

甜菜碱 1mol/L

海藻糖 3%

PEG 4%

BSA 0.3mg/mL

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR启动液的具体组分如下：

品名 摩尔浓度

氯化镁 20mmol/L

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的PCR反应酶系的具体组分如下：

品名 浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）

dNTPs 220μmol/L

聚合酶BSU 140ng/μl

单链结合蛋白 700ng/μl

重组酶（E.coli RecT） 200ng/μl

逆转录酶 0.1U/μl

作为上述反应试剂的进一步改进，所使用的Tris-HCL的pH为9.0。

聚合酶为恒温扩增反应中常用的聚合酶，优选为Bsu或klenow；逆转录酶为逆转录反应中常用的逆转录酶，优选为常温条件下反应的逆转录酶如AMV或者MMLV。重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的特异性引物及探针序列如下：

HCV-F1：CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC

HCV-R1：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC

HCV-P1：

FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ

18S-F1：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC

18S-R1：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC

18S-P1：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ 。

一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的阴阳性质控品如下：

品名 成分

阳性质控品 含有18SRNA、HCV假病毒

阴性质控品 DEPC水 。

下面结合具体的实验，进一步说明一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。

实验样本来源：

以感染HCV血浆经提取得到的核酸溶液作为样本；

以含有内标、HCV假病毒溶液作为阳性质控品；

以DEPC水作为阴性质控品。

实施例1（HCV的检测）：

取3个200μl反应管，分别标记为反应管1~3。在反应管1~3中分别加入35μl的PCR反应液、3μl的PCR反应酶系；2μl引物混合液（HCV-F1、HCV-R1、18S-F1、18S-R1引物浓度分别为0.2μmol/L），2μl探针混合液（HCV-P1、18S-P1探针浓度分别为0.06μmol/L）。在反应管1加入HCV核酸5μl ；在反应管2中加入阳性质控品5μl；在反应管3中加入阴性质控品5μl。最后，在反应管1~3中加入3μl的PCR启动液（各管的终体积为50μl）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。结果如图1。

实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：34℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。

实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：40℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。

实施例4（特异性实验）：

取6个200μl反应管，分别标记为反应管1~6。在反应管1~6中分别加入35μl的PCR反应液、3μl的PCR反应酶系；2μl引物混合液（HCV-F1、HCV-R1、18S-F1、18S-R1引物浓度分别为0.2μmol/L），2μl探针混合液（HCV-P1、18S-P1探针浓度分别为0.06μmol/L）。在反应管1~2中加入HCV核酸5μl ；在反应管3中加入HBV核酸5μl；在反应管4中加入HIV核酸5μl；在反应管5中加入加入阳性质控品5μl；在反应管6中加入阴性质控品5μl。最后，在各管再分别加入3μl启动液（各管的终体积为50μl）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。结果如图4。

实施例5（HCV重复性实验）：

按实施例1配制体系10管，分别标记反应管1~10。在反应管1~8加入HCV核酸5μl，在反应管7~8中加入阳性质控品5μl，在反应管9~10中加入阴性质控品5μl。最后，在各管再分别加入5μl启动液（各管的终体积为50μl）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图5。

结论：

1.从图1的结果可以看出，对应的病原体样本扩增结果都有“S”型扩增曲线，说明本发明试剂盒的恒温扩增效果好。

2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒的容错率高、稳定性强。

3.从图4的结果可以看出，用本发明试剂盒检测HCV核酸特异性好，具有很强的专一性，检测结果无误，说明本试剂盒的特异性好、稳定性强。

4.从图5的结果可以看出，用本发明试剂盒特异性高，只有HCV核酸的样本是“S”型扩增曲线。

综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强、用时短。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效试剂变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州和实生物技术有限公司

<120> 一种丙型肝炎病毒（HCV）恒温检测试剂盒

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<212> DNA

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cagtctatca ccgagtcgaa atcgccggta aagcc 35

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<212> DNA

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