本发明涉及生物
技术领域：
，尤其是涉及一种用于检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组、试剂、试剂盒及应用。
背景技术：
：胃癌是全世界范围内最常见的肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中高居第4位，其死亡率在恶性肿瘤中高居第2位，而有超过70％的胃癌病例存在于发展中国家。我国每年新发胃癌病例约40万例，占世界总发病的40％。在我国胃癌早期诊断率＜10％，一经诊断多为中晚期，5年存活率＜20％；与此同时，发达国家实行全民筛查后，胃癌的早期诊断率高达50％，5年存活率可达60％以上。为此，如何实现胃癌的早发现是降低其死亡率的关键。胃癌90％以上为腺癌，1965年Lauren根据胃癌的组织结构和生物学行为将腺癌分为肠型和弥散型。两者的发生发展过程主要包括以下几个阶段：正常-胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-黏膜内癌-浸润性癌。1978年，世界卫生组织将慢性萎缩性胃炎列为胃癌的癌前状态，伴肠上皮化生、异型增生称之为慢性萎缩性胃炎癌前病变或胃癌前期病变，在慢萎基础上伴发的不完全型肠上皮化生和(或)中、重度异型增生则被视为真正的癌前病变。胃癌癌前病变甚至早期胃癌的治愈率高达90％，所以早期胃癌、癌前病变甚至癌前疾病的发现至关重要。胃癌早期的筛查主要途径包括自然人群普查、门诊机会性筛查和高危人群筛查。我国目前主要采用门诊机会性筛查，主要以参加门诊体检者为筛查对象，通过对血清与胃液标志物检测诊断、电镜诊断以及影像学诊断段对胃癌进行排查，确认胃癌的发生。血清PG水平检测是反映胃黏膜功能和状态的良好指标，具有无创、简便、快速等优点；胃镜检测被认为是胃癌检测的“金标准”，其灵敏度和特异度均超过90％，是目前最直观、最有效的胃癌早期检测手段；在内镜使用之前，钡餐造影是胃癌诊断、筛查的主要手段，但由于其不能取得病理学诊断而逐步被内镜检测取代。临床常规诊断应用于胃癌早期诊断时，胃组织已发生实质性的病变，细胞已发生癌变，真正要做到胃癌的早期筛查，基因诊断被寄予厚望。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组，以缓解现有技术中存在的缺少特异性强、灵敏度高且能够同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物的技术问题。本发明的第二个目的在于提供一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂，以缓解现有技术中存在的缺少特异性强、灵敏度高且能够同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂的技术问题。本发明的第三个目的在于提供一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，以缓解现有技术中存在的缺少特异性强、灵敏度高且能够同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒的技术问题。本发明的第四个目的在于提供上述引物组、试剂或试剂盒在制备用于辅助诊断和/或早期筛查胃癌的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的缺少对胃癌进行早期筛查诊断的有效手段的技术问题。本发明的第五个目的在于提供一种检测胃癌的方法，以缓解现有技术中存在的缺少准确、有效的胃癌早期检测的方法的技术问题。本发明提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组，所述引物组包括用于检测RPRM基因的引物对和用于检测PRDM5基因的引物对；所述用于检测RPRM基因的引物对包括如SEQIDNO.1所示的RPRM基因的上游引物和如SEQIDNO.2所示的RPRM基因的下游引物；所述用于检测PRDM5基因的引物对包括如SEQIDNO.3所示的PRDM5基因的上游引物和如SEQIDNO.4所示的PRDM5基因的下游引物。本发明还提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂，所述试剂包括上述的引物组。本发明还提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，包括上述的引物组或试剂。进一步地，所述试剂盒包括PCRMix和Taq酶Mix；所述PCRMix包括权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂和dNTP；所述Taq酶Mix包括Taq酶和探针。进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；优选地，所述阴性对照品包括TE缓冲液与RPRM基因和PRDM5基因均非甲基化的基因组DNA；所述阳性对照包括TE缓冲液与RPRM基因和PRDM5基因均甲基化的基因组DNA。进一步地，所述试剂盒还包括DNA处理用品；优选地，所述DNA处理用品包括提取DNA的用品及对所述DNA进行亚硫酸盐转化的用品；优选地，所述提取DNA的用品包括裂解液、磁珠和提取漂洗液，对所述DNA进行亚硫酸盐转化的用品包括硫化试剂、结合液、纯化漂洗液和洗脱液。本发明还提供了上述试剂盒在制备用于辅助诊断和/或早期筛查胃癌的产品中的应用。另外，本发明还提供了应用上述引物组或试剂或试剂盒检测胃癌的方法，所述方法包括：将经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA与权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂进行荧光定量PCR反应，根据经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA的Cp值判断是否患有胃癌；当所述RPRM基因的Cp值≤44.76时，则判断患胃癌风险高；和/或，当所述PRDM5基因的Cp值≤38.85时，则判断患胃癌风险高。进一步地，采用磁珠吸附法提取经裂解液裂解后的血浆样本中的DNA，并将所述DNA进行亚硫酸盐转化，再采用磁珠法进行纯化，得到所述经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA；优选地，应用提取漂洗液与无水乙醇的混合液对所述血浆样本中的DNA进行洗涤后，将所述DNA进行亚硫酸盐转化。进一步地，将混有磁珠的结合液与所述经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA混匀进行吸附后，应用纯化漂洗液与无水乙醇的混合液对磁珠进行洗涤，然后应用洗脱液洗脱所述经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组，包括用于检测RPRM基因的引物对和用于检测PRDM5基因的引物对，该引物组特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化水平。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂，包括上述引物组，该试剂特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化水平。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，包括上述的引物组或试剂，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化状态。本发明提供的检测胃癌的方法，将经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA与上述的引物组试剂进行荧光定量PCR反应，根据经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA的Cp值判断患胃癌风险，该方法应用了本发明提供的引物组或试剂或试剂盒，操作简便、易于掌握，能够准确、有效地判断患胃癌情况。本发明还提供了上述引物组、试剂或试剂盒在制备用于辅助诊断和/或早期筛查胃癌的产品中的应用，应用本发明提供的引物组、试剂或试剂盒对胃癌进行早期筛查诊断，具有高灵敏度和高准确度的优点，且筛查方法简单，易于掌握，在胃癌癌前病变或早期胃癌时期准确地检测出胃癌的发生，能够大大提高胃癌的治愈率，具有重大的推广价值。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组，包括用于检测RPRM基因的引物对和用于检测PRDM5基因的引物对；用于检测RPRM基因的引物对包括：RPRM基因的上游引物：5’-GCGAGTGAGCGTTTAGTTC-3’(SEQIDNO.1)；RPRM基因的下游引物：5’-ACCCGCCACGTCCGTC-3’(SEQIDNO.2)。用于检测PRDM5基因的引物对包括：PRDM5基因的上游引物：5’-AGTTTTGTTTCGGGTTTCGC-3’(SEQIDNO.3)；PRDM5基因的下游引物：5’-CATTCCTACTACGAAAACGC-3’(SEQIDNO.4)。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组，特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化水平。本发明还提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂，包括上述的引物组。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂，特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化水平。本发明还提供了一种用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，包括上述的引物组或试剂。本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，能够简便、快速、准确且同时检测RPRM基因和PRDM5基因的甲基化水平。在一个优选的实施方式中，试剂盒包括PCRMix和Taq酶Mix。PCRMix包括上述的引物组或试剂和dNTP；Taq酶Mix包括Taq酶和探针。其中，RPRM的探针序列为：FAM-CGTCGTTTTTTTATTTTTCG-MGB(SEQIDNO.5)；PRDM5的探针序列为：FAM-AGCGTTTAGGTTCGCGTTTT-MGB(SEQIDNO.6)；ACTB的探针序列为：VIC-AGTAAGTTTTTTGGATTGTG-MGB(SEQIDNO.7)。常规进行甲基化检测时应用的是染料法，在本发明的优选实施方式中应用是MGB探针法，其灵敏度更高、特异性更强。将包含引物的组分和dNTP组成PCRMix预混液，同时将Taq酶和探针组成Taq酶Mix预混液，能够在保证用于检测的试剂在使用前不失效的基础上，使该试剂盒在使用时仅需要将2种预混液混合，制备成将PCR预反应液，然后分装至PCR反应容器中，加入等体积的待测样品模板，密封。操作简便，易于掌握。在一个优选的实施方式中，PCRMix和Taq酶Mix还分别包括溶剂。PCRMix中所包含的溶剂例如可以为，但不限于灭菌纯化水、注射用水或双蒸水中的一种或多种；Taq酶Mix中所包含的溶剂例如可以为，但不限于灭菌纯化水、注射用水、双蒸水或TE缓冲液中的一种或多种。在一个优选的实施方式中，试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。优选地，阴性对照品包括TE缓冲液与RPRM基因和PRDM5基因均非甲基化的基因组DNA；阳性对照包括TE缓冲液与RPRM基因和PRDM5基因均甲基化的基因组DNA。在试剂盒中直接包含阴性对照品和阳性对照品，能够保证应用本发明提供的试剂盒进行检测时，对待测样品的检测结果有标准的对照。通过阴性对照品和阳性对照品的检测结果，能够有效判断待测样品的检测结果，同时保证实验的准确性和有效性。在一个优选的实施方式中，试剂盒还包括DNA处理用品。优选地，DNA处理用品包括提取DNA的用品及对提取出的DNA进行亚硫酸盐转化的用品。在试剂盒中直接包含DNA处理用品，只需本发明提供的一套试剂盒，既能够对待测样品进行检测，又满足了检测前的提取及亚硫酸盐转化等预处理，能够达到一盒多用、使用方便的目的。优选地，提取DNA的用品包括裂解液、磁珠和提取漂洗液，对提取出的DNA进行亚硫酸盐转化的用品包括硫化试剂、结合液、纯化漂洗液和洗脱液。优选地，裂解液包括异硫氰酸胍；磁珠包括硅基磁珠；提取漂洗液包括异硫氰酸胍；硫化试剂包括亚硫酸盐溶液，优选为亚硫酸氢钠；结合液包括盐酸胍；纯化漂洗液包括Tris-HCl溶液、氢氧化钠溶液或乙酸溶液中的一种或多种。本发明还提供了上述的引物组或试剂或试剂盒在制备用于辅助诊断和/或早期筛查胃癌的产品中的应用。DNA甲基化与肿瘤密切相关，异常甲基化状态是致癌作用的关键因素。RPRM，位于染色体2q23位点上，它的异常高甲基化与胃癌的发生发展密切相关；PRDM5，位于染色体4q25-26位点上，它在异型增生与早期胃癌中高度甲基化，两种的结合可以作为胃癌辅助诊断与早期筛查的重要标志物。应用本发明提供的引物组、试剂或试剂盒对胃癌进行早期筛查诊断，具有高灵敏度和高准确度的优点，且筛查方法简单，易于掌握，在胃癌癌前病变或早期胃癌时期准确地检测出胃癌的发生，能够大大提高胃癌的治愈率，具有重大的推广价值。另外，本发明还提供了一种应用上述引物组或试剂或试剂盒检测胃癌的方法，包括：将经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA与上述的引物组或试剂进行荧光定量PCR反应，根据经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA的Cp值判断是否患有胃癌；当RPRM基因的Cp值≤44.76时，则判断患胃癌风险高；和/或，当PRDM5基因的Cp值≤38.85时，则判断患胃癌风险高。本发明提供的检测胃癌的方法，操作简便、易于掌握，能够快速、准确地检测患癌情况。在一个优选的实施方式中，进行荧光定量PCR反应包括如下步骤：a)、将PCRMix与Taq酶Mix混匀，得到PCR预反应液；b)、将PCR预反应液分装至PCR反应容器中，加入等体积的待测样品模板，密封；c)、用于检测时的PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、61℃退火40秒，并进行50次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。在一个优选的实施方式中，以ACTB为PCR扩增的内参。其中，内参ACTB的上游引物为：5’-TGGGGTGGTGATGGAGGAGG-3’(SEQIDNO.8)；内参ACTB的下游引物为：5’-CCAACACACAATAACAAACA-3’(SEQIDNO.9)。在一个优选的实施方式中，采用磁珠吸附法提取经裂解液裂解后的血浆样本中的DNA，并将DNA进行亚硫酸盐转化，再采用磁珠法进行纯化，得到经亚硫酸盐转化后的血浆样本DNA。优选地，应用提取漂洗液与无水乙醇的混合液对所述血浆样本中的DNA进行洗涤后，将DNA进行亚硫酸盐转化。具体包括如下步骤：a)、在0.5-2.0mL的血浆样本中加入1.0-4.0mL的裂解液，在10-30℃的条件下振荡孵育10-30min；b)、采用磁珠吸附法提取步骤a)中的游离DNA；c)、应用提取漂洗液与无水乙醇的混合液对步骤b)中得到的DNA进行洗涤；d)、将步骤c)中洗涤后的DNA进行亚硫酸盐转化，并采用磁珠法进行纯化，得到bisDNA(亚硫酸盐硫化后的DNA)。在一个优选的实施方式中，将混有磁珠的结合液与上述bisDNA混匀进行吸附后，应用纯化漂洗液与无水乙醇的混合液对磁珠进行洗涤，然后应用洗脱液洗脱上述bisDNA。具体包括如下步骤：A)、将上述bisDNA与结合液、磁珠混匀，bisDNA吸附到磁珠上；B)、纯化漂洗液与无水乙醇混合，用于步骤A)中吸附有bisDNA的磁珠的洗涤，然后应用洗脱液进行洗脱，得到bisDNA。为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。实施例1试剂盒的组成及待测样品的处理1、本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒，包括DNA处理试剂盒和甲基化基因检测试剂盒。其中，DNA处理试剂盒的组成如表1所示，甲基化基因检测试剂盒的组成如表2所示。表1DNA处理试剂盒表2甲基化基因检测试剂盒试剂主要成分PCRMixdNTP、引物、缓冲盐Taq酶MixTaq酶、探针、缓冲盐阴性对照品TE缓冲液、未甲基化的人基因组DNA阳性对照品TE缓冲液、甲基化的人基因组DNA2、仪器设备：检测所需仪器设备如下所示：漩涡震荡仪、旋转混匀器、15mL磁力架、2.0mL磁力架、金属浴、PCR仪、掌上离心机、微量移液器、超净工作台、Lightcycler480等。3、血浆游离DNA的提取及硫化纯化具体方法如下：1.试剂准备1)提取漂洗液：初次使用前加入等体积无水乙醇，振荡混匀。2)纯化漂洗液：初次使用前加入4倍体积无水乙醇，振荡混匀。2.操作步骤1)取一支15mL离心管(自备)，加入2mL血浆样本，阳性对照品、阴性对照品各取1支室温解冻，加入4mL裂解液，涡旋混匀，室温振荡10-30min。2)加入100μL的磁珠，涡旋混匀，室温振荡10-30min。3)将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃去上清。4)加入1mL提取漂洗液，将磁珠混匀转移至1.5-2mL离心管中，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃去上清。5)重复1次步骤4)。6)加入1mL80％乙醇，涡旋混匀，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃去上清。7)重复1次步骤6)。8)瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，用枪小心去除残留液体，室温放置5-10min。9)向离心管中加入100μL纯化水涡旋混匀，56℃孵育5-10min，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，吸取DNA溶液保存。10)取1支600μL离心管，加入100μLDNA溶液，再加入190μL的硫化试剂、30μL的DNA保护液，涡旋混匀，瞬离。10)将离心管98℃孵育10min，80℃孵育1h。11)冷却至室温，瞬离。取1支2mL离心管，加入1.2mL的结合液，转入上述硫化产物，再加入50μL磁珠，涡旋混匀，室温振荡10-30min，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃上清。12)加入500μL的纯化漂洗液1，涡旋混匀，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃上清。13)加入500μL的纯化漂洗液2，涡旋混匀，室温振荡10-30min，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃上清。14)加入500μL的纯化漂洗液3，涡旋混匀，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃上清。15)加入500μL的纯化漂洗液1，涡旋混匀，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，弃上清。16)重复1次步骤15)。17)取下离心管，瞬离，将离心管放置在磁力架上，磁珠完全吸附后，用枪小心去除残留液体，室温放置5-10min。18)向磁珠加入30-60μL预热到56℃的灭菌水，盖上盖子，涡旋混匀，56℃孵育5-10min，中间再混匀一次。19)瞬离，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附，吸取上清bisDNA至新的离心管内保存。实施例2RPRM和PRDM5甲基化基因的检测1)按照表3反应体系，配制PCR预反应液，混匀后分装至PCR管，待测样品、对照品和纯化水作为模板加入，每个反应体积为20μL；表3PCR反应体系2)按照表4的反应条件进行荧光定量PCR反应。表4反应条件3)样品上机后，保存实验名称，运行PCR反应，并及时根据实验布局编写加样排版和样品名称。实施例3PCR结果分析1.在480基本软件模块栏中选择“Analysis”。2.选择“AbsQuant/FitPoints”分析模式。3.选择“FilterComb465-510”。4.选择“CycleRange”窗口，设定“FirstCycle”为“1”；“LastCycle”为“50”。5.在“CycleRange”窗口中，将背景设定为“5-22”，点击蓝色的“Background”按钮，将“MinOffset”设定为“4”，将“MaxOffset”设定为“21”。6.选择“NoiseBand”窗口，将“NoiseBand”设定为”NoiseBand(Fluoresc)”，并将“NoiseBand”的值手动地改为“2.0”。注：如果背景值高于2.0，可以根据实际情况调整基线，即“NoiseBand”的值，至没有明显指数增长期的扩增曲线应均为阴性。7.选择“Analysis”窗口，“Threshold(Auto)”将“Threshold”值自动调节成与“NoiseBand”值一致，将“FitPoints”设定为“2”。8.点击“CalcuLate”，软件自动给出目的基因RPRM和PRDM5的Cp值。9.选择“FilterComb533-580”。10.点击“CalcuLate”，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。11.PCR结果的具体判读如表5所示：若判读结果为阴性，患胃癌风险性较低；若判读结果为阳性，患胃癌风险较高，建议镜检确认。表5PCR结果的判读实验例临床样本的检测共收集检测56例临床样本应用本发明提供的用于同时检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的试剂盒进行检测，检测结果如下表所示。其中健康人9例，非慢性萎缩性胃炎17例，慢性萎缩性胃炎、肠化生和异型增生共计14例，胃癌16例(2例I期、3例III期、1例IV期以及10例分期不明样本)，临床样本结果显示胃癌检测灵敏度94％，胃癌前病变检测灵敏度86％，整体灵敏度＝A/(A+C)*100％＝90％，特异性＝D/(B+D)*100％＝73％，阳性预测值＝A/(A+B)*100％＝79％，阴性预测值＝D/(C+D)*100％＝86％。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。SEQUENCELISTING<110>江苏为真生物医药技术股份有限公司<120>用于检测RPRM基因和PRDM5基因甲基化的引物组、试剂、试剂盒及应用<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1gcgagtgagcgtttagttc19<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2acccgccacgtccgtc16<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3agttttgtttcgggtttcgc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4cattcctactacgaaaacgc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5cgtcgtttttttatttttcg20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6agcgtttaggttcgcgtttt20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7agtaagttttttggattgtg20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8tggggtggtgatggaggagg20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ccaacacacaataacaaaca20当前第1页1 2 3