57.97% 和 61.98% ;，对 MCF-7 抑制率分别为 56.52%,70.02% 和 39.82%。
[0025]实施例2
(I)取10 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为15% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是:PH=8，酶解温度30°C，酶解时间10 h，酶与底物浓度比为
0.1% (w/w)。该过程中使用0.1 mo I/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在ρΗ±0.05之间，酶解完毕后在95°C水中灭酶15 min，冷至室温，将酶解液在6000 r/min下离心35 min，取上清液。
[0026](2)取步骤(I)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD,5 KD以及3 KD的超滤膜过滤(0)2的压力为0.22 Mpa的室温下)，从而获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
[0027](3)取步骤(2)得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析，柱体积为150 mL，上样量为3 mL，上样浓度为100 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4 min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
[0028]实施例3
(I)取18 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为30% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是:PH=9，酶解温度60°C，酶解时间15 h，酶与底物浓度比为0.5% (w/w)。该过程中使用0.2 mo I/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在ρΗ±0.05之间，酶解完毕后在100°C水中灭酶20 min，冷至室温，将酶解液在8000 r/min下离心60 min，取上清液。
[0029](2)取步骤(I)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD,5 KD以及3 KD的超滤膜过滤(0)2的压力为0.25 Mpa的室温下)，从而获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
[0030](3)取步骤(2)得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析，柱体积为180 mL，上样量为2 mL，上样浓度为70 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4 min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
[0031] 实施例4
(I)取20 g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为50% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶酶解，其水解条件是:PH=8.5，酶解温度55°C，酶解时间12 h，酶与底物浓度比为0.3% (w/w) ο该过程中使用0.15 mo I/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完毕后在85°C水中灭酶17 min，冷至室温，将酶解液在9000r/min下离心55 min，取上清液。
[0032](2)取步骤(I)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD,5 KD以及3 KD的超滤膜过滤(0)2的压力为0.18 Mpa的室温下)，从而获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液。
[0033](3)取步骤(2)得到的0-3 K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析，柱体积为190 mL，上样量为4 mL，上样浓度为120 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4 min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm，共得到4个多肽组份。检测方法与结果参照实施例1。
[0034]本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取3?20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10?50% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，水解过程中使用0.05?0.2 mo I/L的NaOH或HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在ρΗ±0.05之间，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液； (2)取步骤(I)得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10KD,5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD和大于10 KD的金钱龟多肽的酶解液； (3)取步骤(2)得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶S^hadexG-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，分别收集得到4个多肽组份分别命名为E1、E2、E3和E4，即金钱龟抗肿瘤多肽。
2.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述胰蛋白酶水解条件是:pH=7?9，酶解温度30?60°C，酶解时间4?15 h，酶与底物浓度比为0.1%?0.5% (w/w)o
3.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述灭酶为在80?100°C水中灭酶10?20 min。
4.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)所述离心为在6000?10000 r/min下离心30?60 min。
5.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的超滤在0)2的压力为0.1?0.25 Mpa的室温下用超滤杯结合超滤膜超滤。
6.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化，具体条件为:柱体积为100?200 mL，上样量为I?4 mL，上样浓度为20?150 mg/mL，流动相为水，流速为0.3 mL/min，每4 min收集一管，总共收集110管，检测波长为218 nm0
7.根据权利要求1所述的一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于步骤(3)所述金钱龟抗肿瘤多肽组份中El和E2经MALD1-T0F-T0F质谱分析鉴定得到其中三条肽序列为 PGVKGPR、SSPGPPVH和 KLGPKGPR。
【专利摘要】本发明提供一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法。该方法为：取3～20g金钱龟肉糜和超纯水混合后搅拌，配制成浓度为10～50%(w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解完毕后灭酶，冷至室温，将酶解液离心，取上清液；依次用截留分子量分别为10KD、5KD以及3KD的超滤膜过滤，从而获得3种酶解液；0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，水洗脱，在一定的检测波长下收集得到4个多肽组分，即金钱龟抗肿瘤多肽。本发明得到的金钱龟多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。
【IPC分类】C07K1-34, A23L1-29, A61K38-01, C12P21-06, A61P35-00
【公开号】CN104630318
【申请号】CN201510029499
【发明人】张学武, 何胜洁
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月21日