的重组质粒载体为模板，测定 其DNA浓度并换算成拷贝数，绘制标准曲线；用Power soil试剂盒提取番茄盆栽不同处理 土壤的总DNA ;将供试土壤总DNA和获得的重组质粒DNA为模板，进行RT-PCR分析；
[0033] (2)其 RT-PCR 扩增体系为 20 yL :DNA 模板 IyL;上、下引物各 IyL ;SYBR Premix Ex-Taq (DBI) 10 μ L，水 7 μ L ;
[0034] (3)其RT-PCR扩增条件如下：
[0035] Cyclel ：95〇C 2min ；
[0036] Cycle2X40(Real time) ：stepl:95〇C 15s, step2:60〇C 20s ；
[0037] Cycle3(Melt Curve) ：95〇C lmin,60°C lmin,95〇C 20s ；
[0038] (4)其 RT-PCR 扩增的引物为：ituC :ITUC-F :GCCTCCTGCTCATTGTCCTT，ITUC-R : GACGGCGTATCGTGGAGAAT，其它功能基因 RT-PCR采用的引物同菌株DNA功能基因普通PCR引 物一致，如表7所示。
[0039] 本发明的第四个目的是通过下述技术方案实现的：
[0040] 一种含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。
[0041] 进一步的，上述的含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液，所述的发酵液中含有脂肽类 抗生素 surfactin，其含量为64. 24mg/L〇
[0042] 该发酵液的制备方法如下：
[0043] 在超净工作台中把保存在斜面上的菌株接种到平板上活化培养，培养温度28~ 30°C，培养18-36h ;种子液培养：从平板上挑活化的菌落接入种子培养液中，30°C摇床培养 ld，转速150r/min，得到种子液；按5%接种量，将获得的种子液接入发酵培养基中，30°C摇 床培养2~4d，转速150r/min，得到解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液。
[0044] 抑菌活性物质的提取方法如下：
[0045] 取5mL发酵液在10000r/min下离心10min，除去菌体、取上清液，重复该步骤一 次得到无细胞上清液，加入活化的C18萃取柱中，用5mL高纯水洗涤2遍，再分别用ImL的 60%~100%的甲醇溶液萃取，再过0. 22 μm的滤膜，既得抑菌活性物质surfactin的萃取 液。
[0046] 用HPLC仪器测定surfactin含量的方法如下：
[0047] 从sigma公司购买surfactin标准品，用甲醇分别配制成100、250、500、1000ppm 的标准品，用HPLC测定标品和JK6样品，其HPLC的检测条件：色谱柱为Agilent C18柱， 4. 6mmX250mmX0· 5 μπι;进样量 20 yL ;柱温 33-35°C ;检测波长 210nm ;流速 0· 8-1.0ml/ min ;检测时间20min。溶剂：A为水加0. 1% TFA，B为100%乙腈；梯度变化条件如表1所 不O
[0048] 表1surfactin检测时的流动相
[0049]
【主权项】
1. 一株解淀粉芽孢杆菌JK6,保藏编号CGMCCNo. 10658,于2015年03月23日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2. 根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6,其特征在于，其16SrRNA核苷酸序列， 如SEQIDNO. 1 所示。
3. 以权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成 脂肽类抗生素的功能基因； 所述的功能基因如下： 1. yndj，其基因序列如SEQIDNO. 4; 2. fenD，其基因序列如SEQIDNO. 5; 3. ituC，其基因序列如SEQIDNO. 6 ; 4. ituD，其基因序列如SEQIDNO. 7 ; 5. ituB，其基因序列如SEQIDNO. 8 ; 6. ituA，其基因序列如SEQIDNO. 9 ; 7)srfAB，其基因序列如SEQIDNO. 10 ;
4. 根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌JK6基因组为模板进行PCR扩增得到合成脂 肽类抗生素的功能基因，其特征在于，所述的功能基因能够在土壤中成功的表达，其在土壤 中表达的制备方法如下： 1) 以含有功能基因的重组质粒载体为模板，测定其浓度和换算成拷贝数，绘制标准曲 线；用Powersoil试剂盒提取供试土壤的DNA;将供试土壤DNA和获得的重组质粒DNA为 模板，进行实时荧光定量PCR分析； 2)其RT-PCR扩增体系为20 y L :DNA模板I y L ;上、下引物各I y L ;SYBR Premix Ex-TaqlO y L，水7 y L。 3) 其RT-PCR扩增条件如下： Cyclel：95〇C2min； Cycle2X40 ：stepl：95〇C 15s, step2：60°C 20s； Cycle3：95〇C lmin,60°C lmin,95〇C 20s〇
5. -种含解淀粉芽孢杆菌JK6的发酵液，其特征在于，所述的发酵液中含有脂肽类抗 生素surfactin，其含量为 64. 24mg/L〇
6. -种含权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌JK6发酵液的生物肥，其中，所述的解淀粉 芽孢杆菌JK6含量为2XIO8~2X10 1(lcfu/mL。
7. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在产铁载体、产生物膜、产蛋白酶、产过氧化 氢酶、产纤维素酶以及产IAA方面的应用。
8. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在抑制植物真菌病原菌方面的应用，所述 的植物真菌病原菌为香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原 菌、黄瓜枯萎病原菌。
9. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6在防治番茄青枯病方面的应用。
10. 权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JK6或权利要求6所述的生物肥在促进植物生 长中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌JK6及生物肥和应用，该菌株保藏编号为CGMCC No.10658，于2015年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；本发明的解淀粉芽孢杆菌JK6主要用于番茄青枯病的生物防治；该解淀粉芽孢杆菌具备产铁载体、生物膜、蛋白酶、过氧化氢酶、纤维素酶和IAA特性，可有效抑制香蕉枯萎病原菌、荔枝炭疽病原菌、荔枝霜疫霉病原菌、水稻稻瘟病原菌、黄瓜枯萎病原菌等多种真菌病原菌，显著促进生菜植株的生长；K6菌株能够在土壤中成功定殖，并在土壤中表达防病功能基因yndJ、srfAB、fenD和ituC；该菌种繁殖速度快，生产工艺简单，抗逆能力强，易保存，利于工业化生产，利用该菌株制备生物肥，既可以防治土传病害又能促进植物生长，应用前景广阔。CGMCC No.1065820150323
【IPC分类】A01P21-00, A01P1-00, C12Q1-68, C05F11-08, A01N63-00, A01P3-00, C12R1-07, C12N1-20, C12N15-31
【公开号】CN104726383
【申请号】CN201510179403
【发明人】蔡燕飞, 熊汉琴, 李永涛, 郭真真, 张娅娅, 江亚雄
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月15日