、10w/v% 2-疏基乙醇、0? 004w/ v%溴酚蓝、0. 125MTris、pH为6. 8)30yL，在95°C下热处理10分钟，使用在室温下冷却了 的经热变性的蛋白溶液，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确认条带。电泳后，将实施例1的凝胶用 OrioleFluorescentGelStain染色，将其他实施例的凝胶用考马斯亮蓝（CBB)染色，将其 结果示于图1~图4。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)对 染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析，求出目标蛋白（重组蛛丝蛋白）的纯度。其结果 示于下表4中。作为对照，图2和图4中分别也一并示出了实施例2中的使用了大肠杆菌 的溶解物的SDS-PAGE的结果。其中，Oriole Fluorescent Gel Stain时使用L5yg蛋白、 CBB时使用7 y g蛋白进行电泳。
[0134]表 4
[0136] 图1中示出了实施例1中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图1中，LaneM表示分 子量标记物、Lane1表示实施例1中得到的上清液中所含的蛋白。图1中，用箭头表示的 为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12. 5kDa)对应的蛋白的条带。从图1和表4确认了， 通过用含有1M的LiCl的DMS0将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用超纯水稀释， 得到了含有目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-small-M)的上清液。上清液中所含的蛋白中，目 标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-small-M)的纯度为60%以上、精制率高。
[0137] 图2中示出了实施例2~5中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图2中，LaneM 表不分子量标记物、Lane1表不实施例2的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane2、3、 4、5分别表示实施例2、3、4、5中得到的上清液中所含的蛋白。图3中示出了实施例6~8 中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图3中，LaneM表示分子量标记物、LaneI、II、III 分别表示实施例6、7、8中得到的上清液中所含的蛋白。图2和图3中，用箭头表示的为 与ADF3Kai-NN(分子量为约47. 5kDa)对应的蛋白的条带。从图2、图3和表4确认了，通 过用含有〇. 5M的LiCl的DMS0将大肠杆菌溶解，将大肠杆菌的溶解物用各种水系溶剂稀 释，得到了含有目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)的上清液。另外，当使用水与乙醇的混合 液作为稀释用溶剂、且稀释液（大肠杆菌的溶解物与稀释用溶剂的混合液）中的乙醇浓度 为35质量％以下时，与仅使用纯水作为稀释用溶剂时相比，在得到的上清液中所含的蛋白 中，目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)的纯度更高。特别是，当稀释液中的乙醇浓度为10~ 30质量％时，在得到的上清液中所含的蛋白中，目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)的纯度 更高。另一方面可知，稀释液中，当乙醇的浓度达到45质量％以上时，目标重组蛛丝蛋白 (ADF3Kai-NN)的纯度与仅使用纯水作为稀释用溶剂时相比变低。这推测是由于当稀释液中 的乙醇浓度过高时，目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)发生凝聚。
[0138] 图4中示出了实施例9~13中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图4中，LaneM表 示分子量标记物、Lanea表示实施例9的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Laneb、c、d、e、 f?分别表示实施例9、10、11、12、13中得到的上清液中所含的蛋白。图4中，用箭头表示的为 与ADF3Kai-NN(分子量为约47. 5kDa)对应的蛋白的条带。从图4和表4确认了，通过用含 有0. 5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，将大肠杆菌的溶解物用各种水系溶剂稀释，得到 了含有目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)的上清液。另外可知，当稀释用溶剂为pH为3~9 的50mM的Tris缓冲液时，与使用了纯水时同样地可提取目标重组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)。
[0139] 另外，从表4的实施例1、2、14和15的结果可知，使用含有无机盐（LiCl)的DMSO 作为溶解用溶剂时比仅使用不含有无机盐的DMSO时可提取纯度更高的重组蛛丝蛋白 (ADF3Kai-NN)〇
[0140](实施例 16)
[0141] 使用表达ADF4Kai-W蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.lg，除此以外，与实施例2同 样地回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液。
[0142] 使用实施例16中得到的含有ADF4Kai_W蛋白的上清液，如上所述地进行 SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝（CBB)染色，将其结果示于图5中。其中，图5中 还一并示出了使用了实施例16中的大肠杆菌的溶解物、和回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清 液后的沉淀的SDS-PAGE的结果。向回收含有ADF4Kai-W蛋白的上清液后的沉淀中添加含 有2M的LiCl的DMSO,在60°C下静置30分钟，使用溶解后的溶液进行SDS-PAGE。
[0143] 图5中，LaneM表不分子量标记物、Lane1表不大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、 Lane2表示上清液中所含的蛋白、Lane3表示沉淀中所含的蛋白。图5中，用箭头表示的为 与ADF4Kai-W(分子量为约26. 4kDa)对应的蛋白的条带。从图5确认了，通过用含有0. 5M 的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，得到了含有目标重 组蛛丝蛋白（ADF4Kai-W)的上清液。
[0144] (实施例 17)
[0145] (1)在表达ADF3Kai_NN蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.lg中添加lmL含有0.5M 的LiCl的DMS0,使菌体分散，在60°C下静置30分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
[0146] (2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机（T0MY精工 公司制的"MX-305"）将得到的稀释液在20°C、11000Xg下离心分离5分钟，回收含有 ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
[0147](实施例18~21)
[0148] 将大肠杆菌的溶解物用下表5所示的磷酸缓冲液等倍稀释，除此以外，与实施例 17同样地回收含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液。
[0149] 使用实施例17~21中得到的含有ADF3Kai-NN蛋白的上清液，如上所述地进行 SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝（CBB)染色，将其结果示于图6。另外，通过用分析 软件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳照片进行图像分析， 求出目标蛋白（ADF3Kai-NN)的纯度。将其结果示于下表5。其中，图6中还一并示出使用 了实施例17中的大肠杆菌的溶解物的SDS-PAGE的结果。
[0150]表 5
[0152] 图6中示出了实施例17~21中得到的蛋白的SDS-PAGE的结果。图6中，LaneM 表不分子量标记物、Lane1表不实施例17的大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、Lane2、3、 4、5、6分别表示实施例17、18、19、20、21中得到的上清液中所含的蛋白。图6中，用箭头表 示的为与ADF3Kai-NN(分子量为约47. 5kDa)对应的蛋白的条带。从图6和表5可知，当稀 释用溶剂为pH为3~9的50mM的磷酸钠缓冲液时，与使用纯水时同样地能够提取目标重 组蛛丝蛋白（ADF3Kai-NN)。
[0153] (实施例 22)
[0154] 使用表达Flag92-short2-UU蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.lg，除此以外，与实 施例2同样地回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液。
[0155] 使用实施例22中得到的含有Flag92-short2_UU蛋白的上清液，如上所述地进行 SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝（CBB)染色，将其结果示于图7。其中，图7中还 一并示出使用了实施例22中的大肠杆菌的溶解物、和回收含有Flag92-short2-UU蛋白的 上清液后的沉淀的SDS-PAGE的结果。通过在回收含有Flag92-short2-UU蛋白的上清液后 的沉淀中添加含有2M的LiCl的DMSO,在60°C下静置30分钟，使用该溶解后的溶液进行 SDS-PAGE〇
[0156] 图7中，LaneM表不分子量标记物、Lane1表不大肠杆菌的溶解物中所含的蛋白、 Lane2表示上清液中所含的蛋白、Lane3表示沉淀中所含的蛋白。图7中，用箭头表示的 为与Flag92-short2-UU(分子量为约36. 9kDa)对应的蛋白的条带。从图7确认了，通过用 含有0. 5M的LiCl的DMSO将大肠杆菌溶解，然后将大肠杆菌的溶解物用纯水稀释，能够得 到含有目标重组蛛丝蛋白（Flag92-short2-UU)的上清液。
[0157] (实施例 23)
[0158] (1)在表达ADF3Kai-small_M蛋白的大肠杆菌的干燥菌体约0.lg中添加lmL含有 1M的LiCl的DMSO,使菌体分散，在60°C下溶解40分钟，得到大肠杆菌的溶解物。
[0159] (2)将得到的大肠杆菌的溶解物用超纯水等倍稀释，用离心分离机（TOMY精工 公司制的"MX-305"）将得到的稀释液在20°C、11000Xg下离心分离5分钟，回收含有 ADF3Kai-small_M蛋白的上清液。
[0160] (实施例 24)
[0161] 代替含有1M的LiCl的DMSO,使用含有1M的LiCl的DMF，除此以外，与实施例23 同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0162] (实施例 25)
[0163] 代替含有1M的LiCl的DMS0,使用含有1M的LiCl的DMA，除此以外，与实施例23 同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0164] (实施例 26)
[0165] 代替含有1M的LiCl的DMS0,使用含有1M的LiCl的NMP，除此以外，与实施例23 同样地回收含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液。
[0166] 使用实施例23~26中得到的含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液，如上所述地 进行SDS-PAGE。电泳后，将凝胶用OrioleFluorescentGelStain染色，将其结果示于图 8。另外，通过用分析软件ImageLab(Bio_RADLaboratories，Inc.)对染色后的蛋白的电泳 照片进行图像分析，求出上清液中的ADF3Kai-small-M蛋白的纯度。将其结果示于下表6。
[0167] 图8中，下部分的SDS-PAGE结果为使用了含有ADF3Kai-small-M蛋白的上清液的 SDS-PAGE结果，上部分的SDS-PAGE结果为使用了对应的大肠杆菌的溶解物的SDS-PAGE的 结果。图8中，LaneM表示分子量标记物、Lane1、2、3、4分别对应于实施例23、24、25、26。 图8中，用箭头表示的为与ADF3Kai-small-M(分子量为约12. 5kDa)对应的蛋白的条带。
[0168] 表 6
[0170] 从图8和表6可知，使用DMSO、DMF、DMA作为溶解用溶剂时，目标亲水性重组蛋白 的纯度高。而使用NMP作为溶解用溶剂时，目标亲水性蛋白（重组蛋白）的纯度低。当使 用不具有环状结构的非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂时，能够从表达HI为0以下的亲水 性重组蛋白的宿主细胞中以高纯度提取重组蛋白（HI为0以下）。
[0171](实施例 27)