%以上。在实验室测试菌剂芽孢在池塘水体环境的 复活情况，以及对养殖水体中绿色颤藻的溶藻效果。结果显示，菌体在灭菌池塘水体环境能 复活生长，以甘露醇多粘菌素卵黄培养基平板法检测，蜡样芽孢杆菌至少可存活7d以上， 并且可以有效抑制对虾养殖水体中绿色颤藻的生长，但对绿藻和硅藻等有益微藻无明显影 响，在用菌第3~5期间颤藻数量降低60%以上，这表明CZBCl菌株的生长性能和溶藻特性 未因工业化液体一固体发酵生产流程而受到影响。
[0060] 实施例3
[0061] 与实施例2不同的是，蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基为在IL水中包 括葡萄糖8g、玉米淀粉10g、酵母膏12g、氯化钠7g，pH为7. 5。
[0062] 蜡样芽孢杆菌CZBCl固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮 58、豆柏25、玉米淀粉2. 3、葡萄糖1. 0、酵母粉1. 2、磷酸二氢钾0. 25、硫酸镁0. 04、碳酸钙 2. 0,pH为 7. 2。
[0063] 固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压 2. 5min，谷压0. 04MPa，维持9min，峰压0. 30MPa维持19min，发酵时间为26h，发酵温度为 28。。。
[0064] 实施例4
[0065] 与实施例2不同的是，蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基为在IL水中包 括葡萄糖9g、玉米淀粉9g、酵母膏13g、氯化钠4g，pH为7. 3。
[0066] 蜡样芽孢杆菌CZBCl固体发酵的固体培养基由以下质量份配比的原料制成：麸皮 65、豆柏18、玉米淀粉3. 5、葡萄糖0. 8、酵母粉1. 5、磷酸二氢钾0. 15、硫酸镁0. 06、碳酸钙 L5,pH为 7. 2。
[0067] 固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力脉动发酵的参数为：充压 3. 5min，谷压0. 035MPa，维持llmin，峰压0. 22MPa维持21min，发酵时间为28h，发酵温度为 28 ~30°C。
[0068] 实施例5
[0069] 将实施例2方法制备的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂在养殖生产中应 用，结果如下：
[0070] 在广东省的江门市新会区睦州镇和三江镇、中山市民众镇义仓村、茂名市电白区 海墩村的半集约化对虾养殖土池、汕尾市红海湾桥仔头村的集约化对虾养殖地膜池进行菌 剂产品的应用。在不同地区的对虾养殖场均选择了多口标准化的养殖池塘，在常规对虾养 殖技术措施的基础上，养殖全程每7d定期施用溶藻菌制剂，根据天气和水体环境变化实时 调整溶藻菌制剂的用法用量。结果显示，溶藻菌制剂对优化养殖水体微藻藻相的效果明显， 可有效抑制颤藻、微囊藻等有害蓝藻的生长，促进池塘水体形成以小球藻、栅藻、卵囊藻、角 毛藻、小环藻等有益绿藻和硅藻为优势的藻相结构。
[0071 ] 其中，茂名市电白区半集约化对虾养殖土池的溶藻菌制剂用菌池塘和对照池塘的 微藻优势种情况如下表1所示。
[0072] 表1溶藻菌CZBCl对对虾养殖池塘中的微藻优势种的影响单位：cell/L
[0073]
[0074] 用菌池T1、菌池T2和对照池Cl均为茂名市电白区养殖场的半集约化对虾养殖土 池。
[0075] 中山市民众镇义仓村养殖场未使用本发明菌剂前对虾养殖池塘边的蓝藻水华如 图2中所示，同一池塘首次使用本发明菌剂3天后对虾养殖池塘蓝藻情况如图3中所示，从 图3中可以看出蓝藻明显减少，蓝藻数量减少50%~60 %以上，同一池塘首次用菌5天后 再次使用菌剂，二次用菌第4天池塘水体中蓝藻情况如图4中所示，从图中可以看出，蓝藻 水华完全消失，形成绿藻藻相的水色。
[0076] 茂名电白养殖场未使用本发明菌剂的对4下养殖池塘的蓝藻水华如图5中所不，同 一地点使用本发明菌剂的对虾养殖池塘水体情况如图6中所示，从图6中可以看出，该池塘 无蓝藻水华出现，水体形成以硅藻为优势的微藻藻相结构。
[0077] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固体复合发酵方法，其 特征是包括以下步骤： (1) 确定蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基； (2) 菌种活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行活化培养； (3) 扩大培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行扩大培养，得种子液； (4) 液体发酵：将种子液接种到装有步骤（1)中确定的液体培养基中进行液体发酵培 养至芽孢数量达到101°个AiL以上，得液体发酵后的种子液； (5) 固体发酵：将步骤（4)获得的液体发酵后的种子液接种至步骤（1)中确定的固体 培养基中进行固体发酵培养至芽孢数量达到IO9个/g以上，且芽孢获得率达到90%以上， 得固体发酵物； (6) 干燥、粉碎和包装：将步骤（5)获得的固体发酵物经包括干燥、粉碎和包装工序处 理后，即制得溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂。2. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBCl液体发酵的液体培养基 为在IL水中包括葡萄糖8~10g、玉米淀粉8~10g、酵母膏12~15g、氯化钠4~7g，pH 为 7. 2 ~7. 5。3. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（1)中确定的蜡样芽孢杆菌CZBCl固体发酵的固体培养基 由以下质量份配比的原料制成：麸皮58~70、豆柏18~25、玉米淀粉2. 3~3. 5、葡萄糖 0? 8~L 0、酵母粉L 2~L 5、磷酸二氢钾0? 15~0? 25、硫酸镁0? 04~0? 06、碳酸钙L 5~ 2. 0, pH 为 7. 2 ~7. 8。4. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（2)中将保种的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行活化培养 时，培养基为营养肉汤固体培养基，营养肉汤固体培养基的pH为6. 50~7. 20，28~30 °C活 化培养18~24h。5. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（3)中将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBCl菌种进行扩大培养 时，培养基为营养肉汤液体培养基，营养肉汤液体培养基的pH值为6. 50~7. 20, 28~30°C 恒温振荡培养18~24h，转速为180~230rpm。6. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（4)中液体发酵培养时间为18~28h，温度28~30°C。7. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（4)中液体发酵培养后，取样进行实验室显微镜检查，确 认菌种未受杂菌污染，再将获得的液体发酵后的种子液接种至步骤（1)中确定的固体培养 基中。8. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（5)中固体发酵培养采用压力脉动固态发酵反应器，压力 脉动发酵的参数为：充压2. 5~3. 5min，谷压0. 03~0. 04MPa，维持9~Ilmin峰压0. 25~ 0. 30MPa维持19~21min，发酵时间为26~30h，发酵温度为28~30°C。9. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤(6)中干燥采用流化床干燥，将固体发酵物置于流化床 65~70°C烘干至水分10%以下。10. 根据权利要求1所述的溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体一固 体复合发酵方法，其特征是：步骤（6)中粉碎时粉碎机的孔径为60~100目；包装采用防潮 铝箱袋进行真空密封包装。
【专利摘要】本发明公开了一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，以菌剂工业化液体发酵和固体发酵两套发酵系统为平台，建立从种子液培养，菌体的液体—固体复合发酵，发酵物的干燥与粉碎，包装的产品生产工艺流程，提出了溶解颤藻蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵生产的系统解决方案，并形成了相关菌剂产品。该方法既保留了液体发酵方式的高效和高纯度的特点，又兼顾了固体发酵方式的低成本效应，降低了菌剂的生产成本。同时，还保证未因工业化的规模生产使其溶藻特性和其他生态特性受到影响，菌剂产品可用于养殖池塘防控蓝藻水华使用。
【IPC分类】C12R1/085, C02F3/34, C12N1/20
【公开号】CN105087426
【申请号】CN201510362557
【发明人】曹煜成, 李卓佳, 文国樑, 胡晓娟, 徐煜, 徐创文
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年6月25日