。
[0060] 所述DP0引物：根据上述DP0引物设计的要求，用鼠李糖乳杆菌的gy巧基因序列 (GenBankID:AP011548. 1)在NCBI上进行BLAST,根据比对结果在其保守区域设计DP0引 物，上游引物LR-DP0-F设为沈QIDNO:1 :
[0061]5 ' -CAATTCGCGGTAAGATTCTGAATGTmiIAAGCCTCC-3 '，下游引物LR-DP0-R设 为沈QIDN0:2:5' -CATCGGTCATGATGATCAACTTGTGIIIIIGGGCCTTGCTA-3'，产物大小为 159bp;由上海生工生物技术有限公司合成。其中I碱基为次黄嚷岭。
[0062] 实时巧光PCR反应程序如下：
[0063] 95°(：预变性3〇3;95°(：变性53、55°(：退火3〇3、72°(：延伸3〇3,35个循环。
[0064] 采用Li曲t切cleRoche480巧光定量PCR仪（瑞±罗氏公司）进行实时巧光PCR 反应。
[006引步骤Ξ:判断待检样品
[0066] 在每个循环的72Γ阶段结束后收集巧光信号并进行烙融曲线的分析，结果为阳性 (Ct< 35)代表样品中含有鼠李糖乳杆菌，结果为阴性（Ct> 35)则代表样品中未含鼠李糖 乳杆菌。
[0067] 实施例2
[0068] 本实施例对实施例1的检测方法进行了特异性的验证，所用的供试材料：鼠李糖 乳杆菌（ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌（ATCC9595)、格氏乳杆菌（ATCC33323)、约氏乳杆 菌（ATCC33200)、嗜酸乳杆菌（ATCC314)、德氏乳杆菌（ATCC4797)、发酵乳杆菌（ATCC 9338)、植物乳杆菌（ATCC14917)、沙克乳杆菌（ATCC15521)、詹氏乳杆菌（ATCC25258)、 副干酪乳杆菌（ATCC25598)、干酪乳杆菌（ATCC393)共12株乳杆菌，编号依次为1，2， 3, 一,11,12,均保存于暨南大学理工学院食品科学与工程系，均购买于北京中原公司。
[0069] 特异性验证方法如下：
[0070] 将上述的12株乳杆菌标准菌株在MRS液体培养基（购自广东环凯微生物科技有 限公司，货号为027312)增菌培养24h后，取ImL菌液用于DNA的提取，DNA的提取方法W 及实时巧光PCR反应按照实施例1所示进行。
[00川结果对比：
[0072] 结果如图1所示，由图可知，仅2株鼠李糖乳杆菌结果为阳性，另外10株乳杆菌均 为阴性，由此证明本发明设计的DP0引物特异性较好，进一步的，本发明建立的基于DP0引 物的实时巧光PCR方法能够准确对鼠李糖乳杆菌进行检测。
[007引 实施例3
[0074] 本实施例对实施例1的检测方法进行了灵敏度的验证，其方法如下：
[00巧]对实施例2的鼠李糖乳杆菌ATCC53103进行DNA提取，DNA的提取方法见实施例 1，并将DNA梯度稀释至浓度依次为：1化g/μ^Ing/μ^0.Ing/μ^0.Olng/μL共4个梯 度，每个梯度取1μL做模板，且每个梯度均做一平行对照，同时设阴性对照，进行实时巧光 PCR灵敏度试验，实时巧光PCR按照实施例1所示进行。
[007引结果对比：
[0077] 本发明检测方法的灵敏度结果见图2,当DNA浓度稀释到0.Olng/μL时，取1μL DM做模板仍可W检测到巧光信号的增加，Ct值在30~35之间，表现为阳性扩增，而空白 对照没有巧光信号增加。同时采用农业部标准NY/T2066-2011中鼠李糖乳杆菌的特异性 引物化aF/化aR及反应条件对上述梯度稀释的鼠李糖乳杆菌进行灵敏度验证，其中农业部 标准引物序列为化aF: 5' -GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3';化aR:
[0078] 5' -GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3'，产物大小为37化P。结果见图3所示，当DNA浓 度稀释到0.Ing/μL时，取1μLDNA做模板有微弱条带扩增。
[0079] W上结果说明本发明建立的实时巧光PCR的方法比常规PCR检测灵敏度至少高10 倍。
[0080] 实施例4
[0081] 本实施例对实施例1的检测方法中的退火溫度的敏感性进行了验证，其方法如 下：
[008引采用实施例2的12株乳杆菌标准菌株，DNA的提取方法W及实时巧光PCR反应按 照实施例1所示进行，与实施例1不同的是，在实时巧光PCR反应程序中，退火溫度设Ξ个 等级：50°C、55°C和 60°C。
[0083] 结果如表1所示：在50°C、55°C和60°C运Ξ个退火溫度下，本实施例建立的检测方 法均顺利扩增，而且特异性高。由此可见本发明基于DP0引物建立的实时巧光PCR检测方法 在50°C-60°C内退火溫度不敏感，有利于在不同实验室之间得到准确和统一的检测结果。
[0084] 表 1
[0085]
[0087] 其中"+ "表示为阳性，"一"表示为阴性
[008引 实施例5
[0089] 本实施例提供了一种鼠李糖乳杆菌的检测试剂盒，至少包括DP0引物：SEQIDNO: 1 和沈QIDNO:2。
[0090] 优选的，还可W包括SYBRPremixEx化q?、d地2〇、阳性对照、阴性对照，进一步优 选的，还可W包括细菌基因组DNA提取试剂。
[0091] 利用上述试剂盒检测鼠李糖乳杆菌的具体步骤为：使用细菌基因组DNA提取试剂 提取待测样品的DNA，W提取的DNA为模板与DP0引物进行实时巧光PCR反应，反应体系和 反应条件如实施例1所示，同时设阳性对照、阴性对照，根据反应结果判断样品中是否含有 鼠李糖乳杆菌。
[0092]沈QUENCELISTING
[0093] <110〉中华人民共和国灿头出入境检验检疫局冲华人民共和国伊準出入境检
[0094] 验检疫局
[009引<120〉基于DP0引物的实时巧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂
[0096]盒
[0097] <130〉ZSZ001-15P101066
[0098] <160>2
[0099] <170>PatentIn version 3. 3
[0100] <210>1
[0101] <211>38
[010引<212〉DNA
[010引<213〉Artificial[0104] <220〉
[0105] <223〉沈Q ID NO :1
[0106] <400〉1
[0107] caattcgcggtaagattctgaatgtiiiiiaagcctcc 38 [010引<210〉2
[0109] <211>41
[0110] <212>DNA
[01U]<213〉Artificial
[0112] <220〉
[0113] <223〉沈Q ID NO :2
[0114] <400>2
[0115] catcggtcatgatgatcaacttgtgiiiiigggccttgcta 41。
【主权项】
1. 一种引物对，其中一条引物包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，另一条引物包含 SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。2. 权利要求1所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途。3. -种检测样品中鼠李糖乳杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求 1所述的引物对。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶和ddH20，所述Taq酶为 与SYBR染料预混好的ExTaq酶。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括细菌基因组DNA提取试剂。6. -种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引 物对、权利要求3-5中任一项所述试剂盒的步骤。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 实时荧光PCR反应 以含有DNA的样品为模板与DP0引物进行实时荧光PCR反应，所述DP0引物为SEQID NO:1 和SEQIDNO:2 ; 2) 判断待检样品。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤1)之前还包括DNA的提取步骤。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的反应体系如下： SYBRPremixExTaq? 10μL DP0引物 终浓度为0· 2μmol/L DNA模板 50ng ddH20 补足至 20yL。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的反应体系如 下：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95°C预变性30s;95°C变性5s、50-60°C退火30s、 72°C延伸30s，35个循环。
【专利摘要】本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ？ID？NO：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途以及基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法。本发明针对鼠李糖乳杆菌设计特异性DPO引物，建立了实时荧光PCR法，成功实现了种水平的鉴定，灵敏度高；本发明将SYBR？Green？Ⅰ实时荧光PCR和DPO引物检测技术相结合，成功建立了一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力的鼠李糖乳杆菌的检测方法；本发明的DPO引物和方法在不同实验室之间具有通用性；本发明将DPO引物和SYBR？Green？I的实时荧光PCR结合起来，检测结果易于判断，增强了本方法的实用性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105255879
【申请号】CN201510784335
【发明人】孟茹, 魏霜, 周均, 粟有志, 雷红琴, 刘中勇, 吴希阳
【申请人】中华人民共和国汕头出入境检验检疫局, 中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日