min;保存在4°C。
[0063] 同时以基因组为模板进行PCR，过程如1.5中所述，电泳验证DNA大于cDNA。
[0064]将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimple，菌落PCR验证阳性克 隆送测序，测序由华大基因完成。将测序结果在GenBank上进行比对并分析表明，所获得的 天冬氨酸类蛋白酶基因DNA由1574个核苷酸组成，序列如SEQIDNO. 1所示。
[0065]比较得出内含子序列，由此获得Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶完整cDNA序 列，即开放阅读框，该a-淀粉酶基因cDNA的开放阅读框cDNA由1524个核苷酸组成，序列如 SEQIDN0.2**。
[0066]该cDNA编码507个氨基酸，其序列如SEQIDNO.3所示，分子量为51.23kDa。
[0067] 该Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶氨基酸序列与已报道的天冬氨酸蛋白酶 氨基酸序列最高同源度为64%。因此，该基因是一个新的天冬氨酸类蛋白酶基因，将之命名 为GpPIO。
[0068]虽然以上提供了从野生菌株通过PCR方法获得全长天冬氨酸类蛋白酶DNA及cDNA 的方法，但是，本领域的技术人员根据本发明所公开的基因序列，采用其它方法，如人工合 成法，同样可以获得全长天冬氨酸类蛋白酶基因DNA及cDNA，这是显而易见的。
[0069]实施例2含有天冬氨酸类蛋白酶基因的米曲霉重组表达载体的构建及其转化
[0070] 2.1引物设计
[0071 ] SKPlOf:5 'CTAGCTAGCTAGATGCCTTCTTCGGCGGCCGT3 '
[0072] SKP10r:5'TCCCCCGGGGGATCAAACAACAATCAACAATC3'
[0073] 2.2重组表达载体构建
[0074]以连有天冬氨酸类蛋白酶基因开放阅读框的pSKNHG为模板，用2.1所示引物进行PCR扩增;将PCR产物Nhel和Smal双酶切，然后与同样经Nhel和Smal双酶切的米曲霉表达载 体pSKNHG连接，筛选，得到重组质粒(pSKNHGPIO)。
[0075] 2.3米曲霉感受态细胞的制备
[0076]将米曲霉斜面孢子用无菌水洗下，接入液体培养基，过夜培养。
[0077]当培养基中出现大量微小的菌丝体时，停止培养，用Miracloth过滤培养基，保留 菌丝体，并使用溶液I冲洗1~2次，保持菌丝体湿重在200mg~400mg。
[0078] 将菌丝体与酶解液以1:10(每0.lg菌丝体加lmL酶解液)混合，在50mL离心管中进 行酶解，于30°C摇床150rpm酶解2~3小时。
[0079]酶解后，可直接观察到菌丝体的分解，将菌丝体与酶解液的混合物用Mirocloth过 滤，弃沉淀，滤液的白色浑浊即原生质体。
[0080] 将原生质体液3000rpm，4°C离心10分钟，白色沉淀即原生质体，用溶液Π洗涤两 次，最后使用溶液Π悬浮原生质体，可直接用于转化，也可分装在Ep管中，-20°C保存。
[0081 ] 2.4重组表达载体的转化
[0082] 将原生质体200yL与20yL质粒DNA混合，加入50yL溶液ΙΠ，于50mL离心管冰育30分 钟。
[0083] 加入2mL溶液ΙΠ，室温放置5~15分钟。
[0084] 加入4mL溶液Π，5000rpm，4°C离心10分钟，去掉上清，400yL溶液Π悬浮。
[0085]将转化MM上下层培养基分别融化。将转化下层MM培养基倒平板。将MM上层培养基 降至室温与原生质体转化液混合，迅速倒平板，均匀铺平，用锡箱纸包好平板，避光培养，置 于30°C培养箱，培养3天后观察平板长势。
[0086]实施例3米曲霉重组菌的诱导表达及纯化
[0087]3.1在2.5所述MM平板上挑取重组菌的单克隆，接种糊精诱导液体培养基，20°C， 200rpm培养 3 ~5d。
[0088] 3.2抽滤过膜收集上清，测酶活，测定蛋白浓度，并进行蛋白电泳。
[0089]3.3收集的上清首先用1〇11^含1〇11^咪唑的即1溶液以1.〇11117分钟的速度加样到11^ 柱体积的Ni-NTA亲和柱上。然后用依次将NPI-酶液、含20mM、50mM、200mM的NPI溶液洗脱亲 和柱，分别测定洗脱液的酶活并且进行SDS-PAGE电泳，确定最佳纯化条件，并得到纯GpPIO 蛋白，如图1所不。
[0090]实施例4天冬氨酸类蛋白酶酶活测定
[0091]天冬氨酸类蛋白酶酶活测定采用测定酪氨酸浓度的方法进行测定。
[0092] 4.1标准曲线绘制
[0093]取18支试管分成6组(每组3支，平行样），编号，按下表6分别加入标准葡萄糖、去离 子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40°C水浴保温20min，然后在721型分 光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0mg/mL酪氨酸反位液做空白对照。
[0094]表6
[0095]
[0096] 4.2样品酶活的测定
[0097] 取4支试管编号（1号为空白对照），分别加入酶液lmL，1号管立即加0.4mol/LTCA溶 液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmLpH3.0、浓度为1 %牛血清蛋白缓冲液，迅速混匀，并立 即放入40°C恒温水浴准确计时，保温lOmin后，立即加入0.4mo1/LTCA溶液2mL，终止反应，同 时向1号空白管中加入lmL2 %牛血清蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取 出离心或过滤除去剩余牛血清蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液lmL，分别移入另4 支试管中，再加入〇.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂lmL，摇匀，保温显色 20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
[0098] 4.3酶活单位定义
[0099]定义一个酶活单位就是:一个天冬氨酸类蛋白酶酶活单位(U)定义为在给定条件 下，5min内水解产生lmg酪氨酸所需的酶量。
[0100]实施例5a-淀粉酶酶学性质测定
[0101] 5.1温度对GpPIO的影响
[0102] 在pH3(100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)条件下，分别在20°C、30°C、40°C、50°C、 60°C、70°C测定Geomycespannorum天冬氨酸蛋白酶的活性，以最高酶活力为100%，计算其 他温度条件下的相对酶活力。
[0103]用PH3的缓冲液将酶液适当稀释，分别在50°C、60°C、70°C保温，每隔5min取样（至 30min，冰上迅速冷却，在50°C下测定残余酶活力，以没有热孵育的酶液酶活力为100%，计 算相对酶活力，表示酶的热稳定性。
[0104]图2显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶温度曲线，其中GpPIO最适作用温度 为60°C，且在50-70°C仍然保持较高酶活力，属于中温蛋白酶。
[0105] 图3显示Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶温度耐受性，GpPIO在50°C条件下稳 定，60°C较为稳定，而在70°C条件下孵育15min基本失活。
[0106] 5 ·2ρΗ对GpPIO酶活力的影响
[0107]在 40°C，分别在1.0、2.0、3.0(!1(：1-617)、4.0、5.0、6.0(柠檬酸-柠檬酸钠）、7.0(磷 酸二氢钾-磷酸氢二钾）的条件下，测定Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶酶活力，以最 高酶活力为100%，计算其他温度条件下的相对酶活力。
[0108]用上述不同缓冲液将酶液适当稀释，分别在50°C条件下孵育30min，取出置冰上迅 速冷却，在pH5.0、40°C条件下测定残余酶活力，以没有孵育的酶液酶活力为100%，计算相 对酶活力表示酶的pH耐受性。
[0109]图4显不Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶pH曲线，其中GpPIO最适作用pH为 3.0，在pHl.0~5.0区间内具有较高酶活力。
[0110] 图5显不Geomycespannorum天冬氨酸类蛋白酶pH耐受性，其中GpPIO在pHl· 0~5 · 0 的区间内均具有较好的pH稳定性。
[0111]以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上 述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的 简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为 常规技术内容。
【主权项】
1. 一种天冬氨酸类蛋白酶，其特征在于，所述天冬氨酸类蛋白酶是如下(a)或(b)的蛋 白质： (a) 由SEQIDNO:3所不的氣基酸残基序列组成的蛋白质； (b) 将SEQIDN0:3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。2. -种天冬氨酸类蛋白酶基因，其特征在于，编码根据权利要求1所述的天冬氨酸类蛋 白酶。3. 根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白酶基因，其特征在于，其碱基序列如下： 1) 如SEQID勵:2所示的0熟序列；或 2) 在严格条件下可与SEQIDN0:2限定的碱基序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子;或 3) 与1)或2)的碱基序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分 子。4. 一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白 酶基因与表达载体质粒连接构建而成。5. 根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述表达载体质粒是米曲霉表达载体 pSKNHG〇6. 含有根据权利要求2所述的天冬氨酸类蛋白酶基因的表达盒、转基因细胞或重组菌。7. 根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将根据权利要求4所述的 重组质粒转入米曲霉中获得的重组菌。8. -种制备天冬氨酸类蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括发酵培养如权利要 求7所述的含有天冬氨酸类蛋白酶基因的重组菌，得到天冬氨酸类蛋白酶。9. 如权利要求1所述的天冬氨酸类蛋白酶在食品，酿酒，饮料，制药行业中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种天冬氨酸类蛋白酶及其编码基因与应用。所述天冬氨酸类蛋白酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将SEQ？ID？NO：3所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸类蛋白酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明通过基因工程技术，从南极低温菌Geomycespannorum中扩增得到天冬氨酸类蛋白酶基因，并将其转入米曲霉中成功实现异源表达。本发明提供的天冬氨酸类蛋白酶具有较高的最适反应温度，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。
【IPC分类】C12N15/57, C12N15/80, C12N1/15, C12R1/69, C12N9/58
【公开号】CN105420220
【申请号】CN201610052686
【发明人】高蓓, 魏东芝, 贺磊, 张鲁嘉
【申请人】华东理工大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月26日