br>[0038] 甲醇、乙腈:美国Fluka公司；
[0039]乙醇：国药集团；
[0040]二氯甲烷:国药集团；
[0041 ] 二甲基亚砜(DMS0):国药集团；
[0042]超声波清洗器，AS系列，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；
[0043]旋转蒸发仪，R-205B，上海申胜仪器公司；
[0044] D-101大孔树脂:天津富邦化工科技有限公司；
[0045]柱色谱硅胶:青岛海洋化工厂生产；
[0046]薄层色谱硅胶板:青岛海洋化工厂生产；
[0047] ZFB型三用紫外分析仪:上海康华生化仪器制造有限公司；
[0048] 恒温水浴锅:北京医疗电子仪器厂；
[0049] 超声波清洗器(JK-500B):合肥金尼克机械制造有限公司；
[0050] 氮吹仪:北京优晟联合科技有限公司；
[0051 ]分析用液相色谱:依利特高效液相色谱，配UV1201检测器；
[0052] 分析色谱柱:Unitary C18 4.6mmX250mm，5ym，浙江华谱新创科技有限公司；
[0053] 制备色谱柱:(：18，10臟\250臟，5以111，浙江华谱新创科技有限公司；
[0054] 半制备液相色谱:创新通恒的LC3000型；
[0055] DAC制备色谱:创新通恒公司LC6000高效液相色谱；
[0056] 2)具体提取方法:将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成60目以上的粉末，取20kg分两 批用50 %乙醇按料液比1: 3加热回流重复提取2次，每次提取2h，加热提取的温度控制在70 °C，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品， 备用；
[0057] 3)油茶50%醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，以及提取 液中的大量的多糖、蛋白质，鞣质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的 重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸 附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、20%乙醇、80%乙醇洗脱， 每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩，其中80 %乙醇部位总 样-硅胶柱层析合并组分色谱图如图1所示，对D101大孔树脂洗脱得到的三个部位进行分析 显示，水洗部位含有大量多糖和蛋白质等，20%乙醇部位可能含有茶皂苷等中等极性化合 物，但这一部位有大量有色物质干扰，而且样品的紫外吸收较弱，分离难度也较大。80 %乙 醇部位活性较强，富含目标化合物，因此作为重点分离的目标。其中，流动相A为甲醇，B为 水;洗脱程序：〇-l〇min 50 % A，10-20min80 % A，20-2 lmin 100 % A;检测波长 254nm，进样量 10yL；
[0058] 4)将采用80%乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空 白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烷-甲醇（10:1-1:3梯度洗脱），每500mL收集为一个 流份，经过TLC检测合并为 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共计24个组 分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接）；
[0059] 5)经过液相检测，选取其中的第2个单位的洗脱液3-7+3 ' -7 '进行细分，溶解于一 定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶 约80g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脱），每100mL收集为一个流份，经过 TLC 检测合并为 1，2-3，4,5-7,8,9-10,11，12-14,15,16-17,18-21，22-24,25-26,27-30，31， 32-36共计16个流份，12-14利用DAC制备色谱分离(色谱图如图2所示），60wt %甲醇-水梯度 洗脱，得到两个单体化合物C0-6，C0-7，以及两个需进一步纯化的组分，再利用半制备液相 色谱对这两个组分进行制备，40 %乙腈-水恒定洗脱，得到两个单体化合物⑶-12，⑶-13， C0-13即为目标化合物。
[0060] 下面对得到的目标化合物进行结构鉴定，所用的仪器与试剂:NMR:核磁共振所有Η 谱全为400MHz，所有13C谱均为100MHz。核磁共振检测条件:核磁共振一维和二维脉冲序列采 用仪器的相应标准程序，1H-NMR谱采样脉冲宽度90°，累加次数32; 13C-NMR谱采样脉冲宽度 90°，累加次数，2000，H-H C0SY、HSQC、HMBC三种试验采样数据阵均为F2 XFfSCMS X 256，零 填充至2048 X 1024进行FT变换，窗函数处理谱图。
[0061] 具体鉴定过程按照如下操作进行：
[0062] 化合物C0-13,白色无定形粉末，如图3中HRESMS(Positive)显示:m/z 377.1398 [M+H] + (Calcd for C23H2i〇5,377.1389)，753.2779[2M+H] +，283.0956[M+H-C6Hi20] +，结合1Η-NMR及13C-NMR确定化合物CO-13的分子式为C 23H2〇05。
[0063] 匪R图谱如图4所示，从谱图中可以看出，在低场区可以清晰的观察到6组芳基 质子信号，包括一对处于苯基间位的两质子信号S6.49(lH，d，J = 2.3Hz)，6.40(lH，d，J = 2.3他）和四组对称质子信号56.80(2!1，(1，了 = 8.5抱），6.78(2!1，(1，了 = 8.5抱），6.67(2!1，(1，了 = 8.5HZ)，6.62(2H，d，J = 8.5Hz)，根据偶合常数判断四组对称质子信号均为苯基邻位偶 合;S4.14(lH，br d，J = 6.6Hz)为位于吸电基团去屏蔽区的质子信号；在高场区存在δ2.83 (lH，dd，J = 6.6，15.5Hz)，2.72(lH，br (1，了=15.5抱），2.63(2!1，111)和2.52(2!1，111)四组信号， 分属于三组亚甲基。
[0064]结合所有核磁谱图及分析，化合物⑶-13鉴定为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为376，提取纯度 可达95wt %以上，化学结构式为：
[0065]
[0066] 实施例2
[0067] 香豆素类化合物的提取方法如下步骤操作：
[0068] 1)所用的试验仪器与试剂准备与实施例1基本相同；
[0069] 2)具体提取方法:将自然阴干的油茶干燥叶粉碎成70目以上的粉末，取20kg分两 批用60 %乙醇按料液比1: 3加热回流重复提取2次，每次提取2h，加热提取的温度控制在80 °C，合并所得上清液，过滤获得上清液，减压浓缩至无醇味，得到原体积一半的粗提液样品， 备用；
[0070] 3)油茶50%醇提取物样品经过质谱分析，鉴定18个组分，其中的花青素，以及提取 液中的大量的多糖、蛋白质，鞣质等亲水性成分，复杂且难于分离，都不作为本发明研究的 重点。因此需用D101型大孔吸附树脂纯化，方法是：用工业酒精处理约10L的D101型大孔吸 附树脂，用水洗到无醇味，取一半提取液分两次上样，依次用水、30%乙醇、75%乙醇洗脱， 每个梯度洗脱4倍柱体积，根据TLC和HPLC分析结果，各部位合并浓缩；
[0071] 4)将采用75%乙醇洗脱得到洗脱液样品浓缩干燥(约150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，分两次装柱，其中每次空 白层装填硅胶约800g，流动相为二氯甲烷-甲醇（10:1-1:3梯度洗脱），每400mL收集为一个 流份，经过TLC检测合并为 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共计24个组 分(两次硅胶柱的流份用序号后面的符号加以区分，部分流份进行交叉合并，用加号衔接）；
[0072] 5)经过液相检测，选取其中的第2个单位的洗脱液3-7+3 ' -7 '进行细分，溶解于一 定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄层层析硅胶(200-300目），水浴挥干，空白层装填硅胶 约80g。流动相系统为二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脱），每90mL收集为一个流份，经过 TLC 检测合并为 1，2-3，4,5-7,8,9-10,11，12-14,15,16-17,18-21，22-24,25-26,27-30，31， 32-36共计16个流份，12-14利用DAC制备色