谱分离(色谱图如图2所示），90wt %甲醇-水梯度 洗脱，得到两个单体化合物C0-6，C0-7，以及两个需进一步纯化的组分，再利用半制备液相 色谱对这两个组分进行制备，30 %乙腈-水恒定洗脱，得到两个单体化合物⑶-12，⑶-13， C0-13即为目标化合物，，对该化合物进行结构鉴定的过程如下：
[0073] 13C_NMR图谱如图5所示，从谱图中可以看出，低场区δ168.68(02)是内脂羰基特征 信号，δ129.04(02" '，C-6" '），127·68(02'，C-6'），115· 22(03'，C-5'），114.60(C-3" '，C-5" '）是四组苯基对称碳信号，δ157.32(07)，156.19(04'），155.17(C-4" '），152.79(C-10) 是苯环上连氧碳信号；高场区有四个碳信号，结合HSQC可知S37.82(C-3)，35.99(C-2"）， 34.42(C-1"）均为亚甲基碳信号，δ36.29(04)为次甲基碳信号。
[0074]目标化合物的Η-Η⑶SY如图6所示，从谱图中可以看出，在H-H COSY*，δ6.80(Η-2'，6'）与δ6.67(Η-3'，5'）形成典型的对位取代苯的ΑΑ沱自旋系统，δ6.78(Η-2"'，6"'）与 δ6.62(Η-3" '，5" '）形成典型的对位取代苯的ΑΑ沱Β'自旋系统；δ6.49(Η-6)与6.40(Η-8)形 成不完全对称的1，3，4，5-四取代苯的自旋系统;δ2.63(Η-1"）与2.52(Η-2"）形成一组Α 2Β2的 自旋系统，即-CH2CH2-单元;初步推断化合物中含有两个对位取代苯基、一个1，3，4，5-四取 代苯基以及一组-CH 2CH2-单元。54.14(!1-4)，2.72(!1-33)和2.83(!1-313)三个质子两两相关， 结合偶合常数可知δ4.14(H-4)与另外两个质子均为 3J偶合，δ2.72(H-3a)与2.83(H-3b)为2J 偶合，三个质子自成一个自旋偶合体系。
[0075]通过HSQC(图7)将碳氢信号一一对应，再利用HMBC将结构片段拼接起来。对目标化 合物的HMBC图进行解析如下：如图8所示，64.14(!1-4)，2.72(!1-3&)和2.83(!1-313)三个质子 均与脂羰基的S168.68(C_2)相关，H-4位于电负性基团的去屏蔽区，显著移向低场，因此推 测(：-4处于羰基的|3位，(：-3处于€ [位即与羰基直接相连44.14(!1-4)与6132.38((：-1'）， 127.68(02'，C-6'）相关，δ2·72(Η-3α)和2.83(H-3b)与δ132.38(01'），与127.68(02'，C-6'）不相关，表明一个对羟基苯基连接在C-4位：由于δ2.52(Η-2"）和2.63(Η-Γ)均与δ 132.06(C-1"'）相关，而且δ2·52(Η-2"）与δ129·04(Ο2"'，C-6"'）相关，可以推断，另外一个 对羟基苯基片段连接在-CH 2CH2-结构单元的C-2"位。四取代苯基的C-7位连接羟基，C-10位 也与氧原子直接相连，这从C-6和C-8的化学位移可以得到印证，δ2.52(Η-2"）和2.63(Η-Γ) 以及6.49(Η-6)均与Sl41.55(C-5)相关，将四取代苯基片段与-CH 2CH2-结构单元连接起来； 另一方面 56.49(!1-6)，6.40(!1-8)，4.14(!1-4)和2.72(!1-33)均与5114.57((：-9)相关，将四取 代苯基片段与内酯片段连接起来。
[0076] 结合所有核磁谱图及分析，目标化合物鉴定为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素。查Scifinder数据库，该化合物为新物质，分子量为376，提取纯度可 达98wt %以上，化学结构式为：
[0077]
[0078] 总之，经过本发明实施例的提取方法得到的目标化合物经过结构鉴定后均具有相 同的结构，而且这种化合物属于首次发现，对后续研究具有一定的指导意义。
[0079] 实验例1
[0080]将本发明实施例1提取得到的目标化合物进行如下实验：MTS法检测化合物对 RAW264.7细胞增殖活性的影响。将细胞接种于96孔板，分别设空白对照组、试验组（10yg/ mL、30yg/mL和1 OOyg/mL三个不同浓度组），每组设三个复孔。每孔加 MTS溶液20yL，孵育1 -2 小时，利用酶标仪在波长490nm条件下测其吸光值。发现试验组(三组)与对照组吸光度无显 著差异，说明化合物不会影响RAW264.7细胞的增殖活性，从这个实验可以看出本发明提取 得到的目标化合物对机体没有任何副作用；
[0081] 然后再将本发明实施例1的目标化合物进行如下实验:利用浓度为lug/mL的LPS诱 导RAW264.7细胞建立炎症模型。分别设空白对照组、LPS诱导组、LPS与试验组(共三组，化合 物浓度分别为10yg/mL、30yg/mL和100yg/mL)，试验组与LPS诱导组相比，通过RT-qPCR、 Western blot等方法检测，发现试验组均可显著抑制RAW264.7细胞中IL-10、TNF-a、iNOS等 相关炎症因子的转录与表达水平，通过该实验可以发现本发明的目标化合物具有抑制炎症 从而达到进一步抑制癌症等恶性肿瘤的效果，而且效果显著。
[0082] 通过将本发明实施例2提取得到的目标化合物进行实验也呈现相同的结果。
[0083] 其中，该实验中所用的实验仪器主要有:上海团结仪器制造有限公司的倒置生物 显微镜，日本岛津生产的分析天平，德国eppendorf公司生产的低温离心机，北京君意公司 生产的电泳仪、凝胶成像仪、垂直板电泳槽以及水平电泳槽，英国ELGA公司生产的超纯水系 统，六一仪器厂生产的水平摇床等;所用的实验试剂主要有:LPS脂多糖、MTS、H-DMEM培养 基、Tri zo 1试剂、引物、异丙醇、氯仿、溴酸蓝、溴化乙锭、胎牛血清等。
[0084] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种香豆素类化合物，其特征在于，该香豆素类化合物的化学结构式为：2. 权利要求1所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤： (A) 将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏 水、20-30wt %乙醇、75-80wt %乙醇溶液洗脱； (B) 将采用75-80wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲 烷-甲醇，每400-500mL为一个单位收集洗脱液； (C) 将收集的第2个单位的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每90-100mL为一个单位收集洗脱液，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取，即得。3. 根据权利要求2所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，油 茶叶热提取的温度控制在70-80°C。4. 根据权利要求3所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(A)中，热 提取之前先将油茶叶粉碎成60目以上的粉状。5. 根据权利要求4所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，热提取采用50wt % 以上的乙醇为溶剂进行提取。6. 根据权利要求2所述的油茶叶提取物中的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于， 所述步骤(B)中，75-80wt%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液先进行浓缩干燥后，溶解于二氯甲 烷-甲醇中，再进行硅胶层析。7. 根据权利要求6所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(B)中，胶 层析过程中所用的硅胶目粒度控制在200-300目。8. 根据权利要求2所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，将 第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取的步骤包括:将洗脱液经过液相色谱检测后，根 据检测结果采用甲醇-水溶液洗脱，再用半制备液相色谱进行分离，即得。9. 根据权利要求8所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(C)中，甲 醇-水溶液的质量百分比浓度控制在60-90 % ; 优选地，半制备液相色谱进行分离过程中，采用质量百分比浓度为30-40%的乙腈-水 溶液为流动相。10. 根据权利要求2-9任一项所述的香豆素类化合物的提取方法，其特征在于，所述步 骤(C)中，最后所得的提取物中香豆素类化合物的含量在95wt%以上。
【专利摘要】本发明提供了一种香豆素类化合物，化学名称为4-对羟基苯基-5-对羟基苯乙基-7-羟基-3，4-二氢香豆素，提取方法包括：将油茶叶经过热提取、浓缩得到浓缩液，过D101大孔树脂吸附完成后，依次用蒸馏水、乙醇溶液洗脱；将采用乙醇溶液洗脱得到的洗脱液进行硅胶层析，每400-500mL为一个单位收集洗脱液；将收集的第2个单位的洗脱液进行硅胶层析，流动相采用二氯甲烷-甲醇，每90-100mL为一个单位收集洗脱液，将第12-14单位的洗脱液合并后继续分离提取，即得。本发明的香豆素类化合物为一种新型的单一化合物，纯度高，成分明确，无任何杂质，属于首次提取并纯化得到，具有开拓性的意义。
【IPC分类】C07D311/20
【公开号】CN105601600
【申请号】CN201610130288
【发明人】曹清明, 包莉圆, 王蔚婕, 钱月娥, 刘晨曦, 钟海雁
【申请人】中南林业科技大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年3月8日