L裂解液的比例加入裂解液，充分混匀，添加溶菌酶至终浓度为Img/mL(如果裂解液太过 粘稠，添加 raasel至终浓度为化g/mL，RNase A至终浓度为lOyg/mL)，蛋白酶抑制剂视情况 而定，冰浴30min。
[0113] 上述菌体再用超声仪进行裂解，超声仪器的参数设置为超声2s，停顿2s，功率为 300W。直至菌体呈现相对透明的状态停止，注意整个操作过程必须在冰上，防止菌液溫度升 高过多。
[0114] 将裂解后的菌体，4°C下15000Xg离屯、20min收集上清和沉淀。沉淀和上清跑SDS- PAGE电泳，确定融合蛋白的分布情况。
[011引⑤亲和纯化
[0116] 融合蛋白+36GFP-HA2-TCS的N端表达化S-化g，利用Μ亲和层析对融合蛋白进行纯 化。Ni亲和层析使用The QIA expressionist ΤΜ蛋白纯化系统（QIAGEN公司），过程如下：
[0117] 1 )Ni-NTA琼脂糖颗粒先用灭菌双蒸水洗涂2遍，然后用裂解液溶液洗涂3遍，备用。 将步骤④获得的菌体上清，按照每4mL加 ImLNi-NTA琼脂糖颗粒的比例在50mL离屯、管中4°C 混匀解育过夜，4°C下1000 X g离屯、Imin，静置5min，吸取上清，-20°C冻存；
[0118] 2)沉淀的M-NTA琼脂糖颗粒为结合了目的蛋白的颗粒，先用裂解液洗涂1遍，然后 用洗涂液洗涂2遍，洗涂条件如步骤1 )，每次的洗涂液都收集-20°C冻存；
[0119] 3)洗涂后的颗粒进行洗脱，首先用咪挫浓度为0.25M的洗脱液洗脱第1次，然后用 咪挫浓度为0.5M的洗脱液洗脱第二次，洗脱液收集-20°C冻存；
[0120] 4)Ni-NTA琼脂糖颗粒用咪挫浓度为1M的PBS充分洗涂1遍，然后用PBS洗涂2遍，再 用无菌蒸馈水洗涂3遍，加入30%乙醇溶液4°C保存琼脂糖颗粒，W供重复使用；
[0121] 5)将上述各步骤中，上柱上清、各步洗涂液、各步洗脱液跑SDS-PAGE电泳，观察蛋 白纯化情况；
[0122] ⑥超滤
[0123] 根据本实验要求，选择Millipore Amicon叫tra-1530K规格的超滤管，超滤浓缩 的过程中更换缓冲液为PBS，过程如下：
[0124] 1)首先用PBS预清洗超滤管，甩掉洗涂液，备用；
[0125] 2)步骤⑤中获得的两次洗脱液预先混合，每个超滤管中加入lOmL洗脱液；
[01%] 3)使用摆桶式离屯、机，3000Xg离屯、20min，去除套管中的溶液，超滤管中用PB巧h 足至lOmL，再次离屯、，重复运个过程3次；
[0127] 4)收集超滤管中浓缩的蛋白溶液，用于后续的实验。
[012引实施例4重组+36GFP-HA2-TCS融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤效应
[0129] (1)融合蛋白+36GFP-HA2-TCS诱导肿瘤细胞调亡的化spase3/7检测
[0130] Caspasc-Uio驳3/7检测试剂盒购自Promega公司，按照厂家说明书，Caspase3/7检 测操作过程如下：
[0131] ① A549细胞传代接种于96孔板，待细胞融合度达到70-80 %时，加入药品（本实验 中是蛋白溶液），浓度分别为 0.104]?、0.154]\1、0.2化]\1、0.254]\1、0.304]\1、0.3扣]\1、0.404]\1，每个 浓度梯度至少设立3个复孔，放入37 °C二氧化碳培养箱解育化。
[0132] ②取出化spase3/7检测试剂盒，在室溫下平衡，重复混匀A、B溶液。
[0133] ③取出培养板，室溫平衡，每孔加入1(Κ)化检测试剂。
[0134] ④作用lOmin后，化学发光酶标仪检测实验结果。
[0135] 96孔板必须是四周为黑色，底面透明的培养板，防止相互干扰;每孔加入药品或是 检测试剂后，必须换枪头，防止相互间的交叉污染;室溫波动对于检测结果有影响，如果溫 度波动过大，可W考虑使用恒溫解箱。
[0136] 如图6和7所示，加药作用于肿瘤细胞1小时后的化spase3/7测定结果显示，融合蛋 白+36GFP-HA2-TCS对人肺癌A549细胞株和小鼠黑色素瘤B16细胞株诱导细胞调亡的能力都 较单独的TCS蛋白有了显著的提高，在0.10-0.40μM的浓度范围内，融合蛋白+36GFP-HA2- TCS处理肿瘤细胞，随浓度递增其诱导人肺癌A549细胞株和小鼠黑色素瘤B16细胞株调亡指 标Caspase3/7酶也急剧增加，在0.40?χΜ的浓度时，其相比于未处理细胞的化spase3/7酶增 幅值达14-16倍(图6、7)。
[0137] (2)细胞结晶紫染色实验
[0138] TCS:天然天花粉蛋白；+36GFP:超正电荷绿巧光蛋白；+36GFP-HA2-TCS:融合蛋白。 Ξ组实验中，每组都设立10个浓度梯度，分别是ΙμΜ，2μΜ，3μΜ，4μΜ，5μΜ，6μΜ，7μΜ，祉Μ，9μΜ和 1 ΟμΜ，每个浓度值设立3个复孔，同时还设有对照组。实验步骤如下：
[0139] ① Α549细胞传代接种于96孔板，待细胞融合度达到70-80%时，加入药品（本实验 中是蛋白溶液），放入37°C二氧化碳培养箱解育24h。
[0140] ②弃去培养液，用PBS小屯、洗涂一次，每孔加10化L 10%甲醇溶液固定细胞30s。
[0141] ③吸去甲醇溶液，每孔加1(Κ)化结晶紫染液，室溫中放置20min。
[0142] ④轻轻弃去染液，蒸馈水洗涂各孔，室溫干燥，相机拍摄结果。
[0143] 如图8所示，+36GFP-HA2-TCS天花粉融合蛋白组在ΙμΜ的起始浓度即将肿瘤细胞溶 解殆尽，而TCS天然天花粉蛋白组在最高浓度的ΙΟμΜ条件下也没有将肿瘤细胞全部溶解。
[0144] (3)融合蛋白+36GFP-HA2-TCS对肿瘤细胞生长抑制作用的ΜΤΤ检测
[0145] ① Α549、Β16细胞传代接种于96孔培养板，待细胞融合度达到70-80%时用于实验。
[0146] ②设计实验的浓度梯度和时间梯度，每个浓度梯度至少设立3个复孔，准备好实验 用到的蛋白溶液，加入96孔板的对应孔中，放入37°C二氧化碳培养箱解育。
[0147] ③待细胞与药品解育相应时间之后，每个孔中添加 50化1 XMTT溶液，继续放入培 养箱解育地。
[0148] ④取出培养板，去除每个孔中的液体，添加15化L DMS0,摇床上震荡lOmin。
[0149] 酶标仪检测0D490nm处的吸光值，分析实验结果。
[0150] 其中人肺癌A549细胞株MTT实验，药物作用化，加药浓度为0.10μΜ、0.15μΜ、0.20μ 1、0.2541、0.3041。结果如表1和图9所示。作用化，融合蛋白对人肺癌4549细胞株细胞生长 抑制率达到50% (ICso)的浓度约为0.20μΜ，而天然天花粉蛋白TCS在浓度为0.30μΜ时对人肺 癌Α549细胞株几乎没有杀伤作用。
[0151] 表1人肺癌Α549细胞株ΜΤΤ实验
[0152]
[0154] 注:Ρ值<0.01极显著;Ρ值<0.05显著。
[01W] 小鼠黑色素瘤Β16细胞株ΜΤΤ实验，药物作用时间设置12h、24h和36h，加药浓度为 0.0化]?、0.0化]\1、0.034]\1、0.0化]\1、0.0扣]\1、0.0化]\1、0.0化]\1、0.0祉]\1、0.0化]\1、0.1化]\1。结果如 表2和图10所示，天然天花粉蛋白TCS对小鼠黑色素瘤B16细胞株几乎没有杀伤作用（期间细 胞反而有所扩增），而本发明产品呈现明显浓度依赖性肿瘤杀伤效应;作用12h，融合蛋白对 小鼠黑色素瘤B16细胞株细胞生长抑制率达到50%(IC50)的浓度约为0.046μΜ;作用2地，融 合蛋白对小鼠黑色素瘤Β16细胞株细胞生长抑制率达到50%(眼〇)的浓度约为0.047μΜ，推 测是因为培养时间较长后，一些耐药性较强的细胞进行了增值。
[0156]表2小鼠黑色素瘤Β16细胞株ΜΤΤ实验
[0157]
[015引注:P值<0.01极显著;P值<0.05显著。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，包括超正电荷绿色荧光蛋白、流感病毒血凝素 HA2亚基 和天花粉蛋白。2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包括连接肽。3. 如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，由超正电荷绿色荧光蛋白、流感病毒血 凝素 HA2、连接肽和天花粉蛋白依次连接组成。4. 如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，包括组氨酸标签序列。5. 如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，超正电荷绿色荧光蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 1所示，天花粉蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，流感病毒血凝素 HA2亚基 的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。6. 编码如权利要求1-5任一所述融合蛋白的基因。7. 如权利要求6所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。8. 包含如权利要求6所述基因的重组载体和转化子。9. 如权利要求1-5任一所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌或黑色素瘤。
【专利摘要】本发明公开了一种融合蛋白及其应用。所述融合蛋白包括超正电荷绿色荧光蛋白、流感病毒血凝素HA2亚基和天花粉蛋白。本发明将超正电荷绿色荧光蛋白、流感病毒血凝素HA2亚基与天花粉蛋白融合，获得的融合蛋白能高效穿过细胞膜进入肿瘤细胞，大大增强了其抗肿瘤活性，降低有效药物浓度。
【IPC分类】C12N15/62, C07K19/00, A61P35/00, A61K38/16
【公开号】CN105669869
【申请号】CN201610099488
【发明人】阎辉, 罗砚曦
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月23日