六烷基三甲基溴化胺(CATB)和7ml三甲苯(TMB)混合均匀，在80°C下剧烈搅拌4h，再加入5.0ml正硅酸四乙酯(TEOS)，混合均匀，继续在80°C剧烈搅拌2h，冷却，在9000转/分钟转速下离心过滤，用无水乙醇洗涤，重复三次。之后沉淀40°C下真空干燥，即得介孔S12纳米微球。
[0034](2) S12纳米微球胺基功能化
[0035]取上述Si02m米微球200mg于圆底烧瓶中同时加入磁力搅拌子，加入无水乙醇40mL，之后加入200mg 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，混合后通N2半小时以排出空气，在磁力搅拌器中水浴80°C条件下反应6h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球；
[0036](3) T12纳米球的制备
[0037]2.0g油酸钠于50ml烧杯中，加入15ml乙醇和1ml水，搅拌，并密封，逐渐缓慢滴入1.0ml钛酸四丁酯(ΤΒ0Τ)，搅拌，将所得溶液移至水热反应釜，至于烘箱中150°C，反应12ho将所得混浊液离心，取沉淀加二氯甲烷溶解离心，洗涤；之后沉淀40°C下真空干燥，即得介孔T12纳米微球。
[0038](4) T12纳米球羧基功能化
[0039]取200mg上述T12纳米微球于50ml小烧杯中，加入40ml 二氯甲烷溶解，加搅拌子搅拌，并加入30mg 3-巯基丙酸(MPA)，混合后通队半小时以排出空气，置于30°C下反应2h，反应完成后离心分离(9000转/min，5min)，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的T12纳米微球。
[0040](5)功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球的制备
[0041]在250mL圆底烧瓶中加入上述制备得到的胺基化的介孔3丨02纳米微球150mg和T12纳米球40mg，分散于50mL水中，然后加入交联剂1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) 10mg、琥珀酰亚胺(NHS) 10mg，混合后通N2半小时以排出空气，在搅拌作用下于30°C条件下反应2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔3102/1102复合纳米微球。
[0042]实施例2:介孔Si02/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱的制备
[0043]A.萃取柱的准备
[0044]1、空柱材料和规格
[0045]现有的固相萃取小柱空柱规格从100 μ L?ImL不等。空柱材料为聚丙烯，小柱上下各有20 μπι孔径的聚乙烯筛板，上述空柱均可使用于本发明中。在下面的实验例中本发明采用ImL的规格。
[0046]2、固相萃取柱的填料
[0047]固相萃取柱的填料为功能化的介孔Si02/Ti0；^合纳米微球，介孔S12纳米微球直径为50?150nm，平均孔径为4?5nm，介孔S12纳米微球表面附着T1 2纳米球，T1 2纳米球直径为3?5nm ;固相萃取柱空管容积为100 μ L?lmL，填装高度为0.2?0.5cm，空管材质为聚烯烃。
[0048]所述的一种功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球的固相萃取小柱，制备方法为:
[0049](I)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5 ?20um ；
[0050](2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球干法填装入柱内；
[0051](3)在填装的功能化介孔3;102/1102复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙稀上筛板，聚乙烯筛板孔径为5?20 μ m，压紧填料使填装柱高度保持在0.2?0.5cm,制备得到固相萃取小柱。
[0052]3、填装量和填装高度的选择
[0053]用前述A准备的材料填装ImL固相萃取柱，如附图1，将一片多孔性聚乙烯下筛板3置于固相萃取柱管I底部，称取相当于固相萃取柱空管容积二分之一的功能化介孔S12/T12复合纳米微球4放入固相萃取柱管I中，然后将多孔性上筛板2放在填料上部，压紧填料使填装柱高度保持在0.3cm，得到功能化介孔3102/1102复合纳米微球固相萃取小柱。
[0054]实施例3:选择β-酪蛋白作为研宄目标物，对所述固相萃取小柱的各项性能指标进行测试
[0055]实验材料:β -酪蛋白购自于上海阿拉丁试剂有限公司，批号为:SLBK9882V ;胰蛋白酶(I: 250)购自于上海阿拉丁试剂有限公司，批号为:20130929 ;2，5_ 二羟基苯甲酸，批号为:J1312017，购自于南京化学试剂有限公司。
[0056]实验仪器和设备:质谱仪为MALD1-TOF-MS (AximaT0F2mass spectrometry,Shimadzu, Kyoto，Japan)、按上述实施例2中制备的功能化介孔3;102/1102复合纳米微球固相萃取小柱。
[0057]实验过程:
[0058](I)取β -酪蛋白配成lmg/mL的标准溶液备用(ρΗ8.0，50mM碳酸氢钱溶液为溶剂);取胰蛋白酶配成0.05mg/mL的标准溶液备用(pH8.0，50mM碳酸氢铵溶液为溶剂);取2，5- 二羟基苯甲酸配成20mg/mL基质溶液备用(1.0 %磷酸水溶液:乙腈混合液(v/vI: 4)为溶剂)；
[0059](2) β -酪蛋白原消化样品液的制备:在37°C条件下，β -酪蛋白标准溶液与胰蛋白酶标准溶液以10: I摩尔比混合，振荡2小时，得到β-酪蛋白的胰蛋白酶消化样品液；
[0060](3) 酪蛋白富集液的制备:用前述A准备的介孔Si02/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱尖端吸入β -酪蛋白原消化样品液，用pH 4.0缓冲溶液(10mM醋酸盐缓冲液:乙腈混合液(v/v4: I) pH 4.0)洗涤三次，分离出非磷酸化多肽；用？11 1.0解吸溶液(1%三氟乙酸水溶液:乙腈混合液(v/v I: 1)ρΗ1.0)洗脱被吸附的磷酸化多肽，收集到容器中而得到酪蛋白富集液；
[0061 ] (4)取IuL β -酪蛋白富集液沉积到MALDI革巴，同时滴入IuL基质溶液至试样斑；样品在空气中干燥后，用MALD1-TOF-MS分析得到经固相萃取小柱富集后的β -酪蛋白的质谱图，如附图4所示；
[0062](5)取IuL β -酪蛋白原消化样品液沉积到MALDI革巴，同时滴入IuL基质溶液至试样斑；样品在空气中干燥后，用MALD1-TOF-MS分析得到没有经过富集的β _酪蛋白的标准质谱图，如附图5所示。
[0063](6)实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各ImL依次洗涤，以备重复使用。
[0064]质谱测定条件如下:
[0065]采用正离子反射模式，加速电压20kV，平均200个激光点产生一个波谱。样品基质为20mg/mL的2，5- 二轻基苯甲酸溶液，其组成为乙腈:1.0%的磷酸水溶液=4: 1lyL样品点在样品台上，随后基质溶液I μ L点样，当样品点空气中风干后开始分析。
[0066]结果表明对于上述磷酸化蛋白的富集加标回收率均能达到92% -105%，解吸过程简单，乙腈就可将上述物质洗脱下来，实验结束后，将固相萃取小柱用乙腈、甲醇各ImL依次洗涤，无需其他操作，即可重复使用。
[0067]以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。
【主权项】
1.一种介孔S1 2/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱，其特征在于所述的固相萃取柱的基质为功能化的介孔Si02/Ti02复合纳米微球，介孔Si02m米微球直径为50?150nm，平均孔径为4?5nm，介孔S12纳米微球表面附着T1 2纳米球，T1 2纳米球直径为3?5nm ;固相萃取柱空管容积为100 μ L?lmL，填装高度为0.2?0.5cm,空管材质为聚烯烃。
2.—种制备权利要求1所述的功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球的方法，其特征在于由原始介孔S12纳米微球及T12纳米球分别经胺基化、羧基化共价化学修饰所得，共价化学修饰按以下步骤进行: (1)介孔S12纳米微球表面胺基化:在无水乙醇溶剂中加入介孔S12纳米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔S12纳米微球与APS的质量比为2:1?1: 5，介孔S12纳米微球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通N2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于50?90°C条件下反应5?24小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球； (2)T12纳米球表面羧基化:在二氯甲烷溶剂中加入制备得到的1102纳米球及3-巯基丙酸(MPA)，1102纳米球和MPA的质量比为20:1?4:1，T12纳米球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通队半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10?40°C条件下反应0.5?2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得干燥后的羧基化的1102纳米球。 (3)功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球的制备:在水溶液中加入制备得到的介孔S12纳米微球和T12纳米球以及交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚胺(NHS)，Si02/Ti0,量比为4:1?3:1，S1 2与EDC、NHS质量比为(20?5):1: 1，介孔S12纳米球的质量浓度为2mg/mL?20mg/mL，混合后通1^2半小时以排出空气，然后在搅拌作用下于10?40°C条件下反应0.5?2小时，反应完成后离心分离5min，转速为9000转/min，用乙醇洗涤沉淀物，离心产物真空干燥，得功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球。
3.如权利要求1所述的一种功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球固相萃取小柱，其特征在于制备方法为: (1)将一片多孔性聚乙烯下筛板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯筛板孔径为5?20 μπι ； (2)将相当于固相萃取柱空管容积三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02复合纳米微球干法填装入柱内； (3)在填装的功能化介孔3102/1102复合纳米微球上放入另一片多孔性聚乙烯上筛板，聚乙烯筛板孔径为5?20 μm，压紧填料使填装柱高度保持在0.2?0.5cm，制备得到固相萃取小柱。
【专利摘要】本发明涉及一种功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球固相萃取小柱及其制备方法，固相萃取小柱的基质为功能化的SiO2/TiO2复合纳米微球，是由原始介孔SiO2纳米微球经胺基化、TiO2羧基化共价化学修饰，然后通过酰胺反应复合所得。该功能化介孔SiO2/TiO2复合纳米微球的填装高度为(0.2～0.5)cm。主要适于富集生物体液以及复杂基质中的磷酸化肽。本发明固相萃取柱具有对目标物质回收率高(92％-105％)，制备成本低，材料易得，功能化过程简单，适应性强，易于批量生产的特点，具有很好的应用前景。
【IPC分类】B01J20-283, G01N30-08, B01J20-30
【公开号】CN104689806
【申请号】CN201510124489
【发明人】胡玥, 朱栋, 王军, 朱俊明, 顾超前, 倪雯婷, 周雪莲
【申请人】南京中医药大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月18日