专利名称：一种无需借助pcr的基因检测方法
技术领域：
本发明属于分子诊断领域，涉及一种无需借助PCR的基因检测方法。
背景技术：
公共健康问题一直都是在世界范围内备受关注的。例如，乙肝病毒和丙肝病毒是 慢性肝炎发病的主要原因，并直接导致肝癌。人类免疫缺陷病毒造成艾滋病感染，梅毒螺旋 体引起性传播疾病——梅毒，现代科技对于这些疾病还不能很好控制与治疗。事实上，不管 是癌症还是传染性疾病都是人类健康的主要威胁之一，这主要是由于缺乏有效的早期诊断 方法，相应的预防疫苗和对治疗切实有效的药物。与后两者相比，疾病的早期诊断在控制疾 病发展和传播上不失为一个最重要的手段。从预防的角度来讲，实验室诊断包括传统的抗 原-抗体反应以及复杂的分子生物学诊断方法，这些都是诊断疾病有效的重要的方法。与 抗原_抗体检测相比，以生物大分子为基础的分子生物学诊断主要是在疾病早期检测致病 病原微生物的遗传物质——核苷酸，这可以把疾病的窗口期由几个月缩短到几天。窗口期 缩短对控制疾病的传播非常重要。当前检测传染性疾病生物样品中生物标志物(包括核酸 和蛋白质)的主要手段有酶联免疫吸附试验(ELISA)，聚合酶链式反应(PCR)产物与探针杂 交并凝胶显影等，其中像酶联免疫吸附试验(ELISA)这类属于以抗原-抗体反应为原理的 检测手段，机体感染病原微生物后产生抗体需要数月甚至更长的时间，这个时间几乎相当 于疾病窗口期的时间。另外就是以PCR技术为基础衍生出来的各种检测方法，这些方法检 测生物样本中的目标基因虽然也具有很多优点，而且是目前临床抗原-抗体检测方法的主 要辅助或者再确认“金标准”手段，但这些方法存在着PCR技术本身带来的“假阳性”，易被 污染，技术要求高，繁琐费时等缺点。虽然这些方法可以在分子水平进行检测，但是传染病 的快速传播使建立费用低廉、结果可靠、灵敏度高、特异性高、操作简便、可同时进行多种疾 病诊断的高通量DNA检测技术成为越来越需要迫切解决的问题。纳米粒子(nano-particle)也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1 IOOnm间的粒子， 是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，它是一种优良的生物分子标记物，使用纳米材 料制成的纳米探针用于基因检验的方法逐渐引起了分子诊断学等各个领域的广泛关注，越 来越显示出光明的发展前景。近年来，质谱(MS)技术得到迅速发展，已被广泛应用于化工、石油、医药、生物等 领域，成为科研和生产中十分重要的工具。特别是20世纪80年代中期出现的基质辅助激 光解析离子化(MALDI-TOF-MS，TOF MS)和电喷雾电离(ESI)两种软电离方式的出现，因 其具有检测范围广、灵敏度高、操作简便、自动化程度高、快速等特点，已广泛用于生物学、 临床医学、环境学等领域的研究。目前，德国Qiagen公司开发的一套有机分子编码核酸 的技术，建立了 64个编码核酸的标记库，利用质谱技术可同时检测22种病原体(Tgomas Briese,et al. Diagnostic system for rapid and sensitive differential detectionof pathogens.Emerging inferctious diseases，2005，11 (2)，310-313. Kokoris，Mark， et al. High—thro μ ghput SNP genotyping with the Masscode system. Molec μ LarDiagnosis, 2000，5 (4)，329-340.)。该方法通过可控的光切技术把小分子标记物连接到核 酸上，经过PCR扩增，再进行生物识别，最后通过光照把标记物释放出来，采用质谱检测做 出判断。该方法设计十分巧妙，但是该方法需要把标记物通过化学方法连接到生物分子上， 而检测时需要把标记物通过化学反应再释放出来，这个过程不仅技术要求高、操作繁琐而 且费时、费力。
专利CN101281164A中公开了一种组装质量编码纳米探针的方法，但靶目标的检 测必须经PCR将信号放大后，才能达到所述的检测灵敏度，而且也没有涉及到关于实际应 用方面的内容，即在实际生物样品中该方法的耐用性考察。其具体过程是将编码分子和相 应的识别分子修饰到金纳米粒子表面，制成胶体金纳米探针。通过杂交，与靶基因结合，再 利用处理后的硅片对纳米探针-靶目标复合物进行分离，最后采用质谱检测胶体金纳米探 针表面的编码分子，从而实现对靶DNA的检测。其中编码分子为可与金纳米粒子结合的有 机小分子，可被质谱检测；而识别分子为一段可与靶DNA发生特异性识别的DNA序列。处理 过的硅片具有捕获金纳米探针_靶DNA复合物的作用，这是因为硅片表面连接有另外一段 可与靶DNA发生特异性结合但不同于识别分子的DNA序列，这种修饰的硅片只有分离和纯 化作用，不具有浓缩靶目标的作用。该方法通过纳米探针实现信号的编码和放大，且无需把 编码分子从纳米探针上释放出来，即可直接对其进行检测。质谱检测编码分子，自动化程度 高、灵敏度最高可达10_14M。但是该专利最大的缺陷是尚需通过PCR扩增靶DNA，靶基因的 浓度提高后才能对其进行检测，整个操作过程繁琐，费时，灵敏度也达不到临床检测需要的 水平。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，为满足生物样本检测尤其是疾病早期诊断 的临床现实需求，提供一种不再需要PCR技术对靶目标进行信号扩大的生物磁性纳米探针 结合质谱技术进行基因检测的方法。本发明原理如下本发明采用的生物磁性纳米探针由胶体金纳米探针和捕获探针 组成。纳米探针为在金纳米颗粒表面通过自组装，连接包括用来识别靶目标的识别分子和 作为信号阅读和信号放大的编码分子。捕获探针是在磁性粒子表面连接有可识别靶目标的 另一个生物大分子，捕捉探针在靶目标存在的环境中起到分离、纯化和浓缩的作用。当生物 磁性纳米探针与靶目标相遇，可形成由纳米探针、靶目标、捕获探针3部分组成的夹心式复 合物。利用捕捉探针分离纯化该夹心结构，洗涤除去其他干扰物质，去杂交释放出纳米探 针，通过质谱测定纳米探针表面的编码分子，从而判断被测样品中靶目标的存在与否情况。本发明的目的可以通过以下措施达到一种基因检测方法，包含如下步骤利用修饰有识别分子和编码分子的纳米粒 子为纳米探针及修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，分 离出该夹心式复合物，释放出纳米探针，通过质谱直接检测纳米探针表面编码分子的分子 离子峰，其中纳米探针中编码分子与识别分子的比例为300 2000 1，优选1300 2000 1。所述的形成夹心式复合物的杂交反应体系的盐浓度为0.2 1.0M，优选0.5 0.7M。所述的盐一般为氯化钠。实验结果显示DNA分子之间的杂交效率随着体系中盐浓度的提高而提高，体系的稳定性也提高，但是太高的盐浓度(浓度超过1M)却抑制杂交，并产 生非特异性杂交。研究发现盐浓度在0. 2 1. 0M，特别是在0. 5 0. 7M不仅可以确保较高 的杂交效率，而又不出现非特异性杂交的问题。所述的质谱为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱或电喷雾质谱，优选基质辅 助激光解析离子化飞行时间质谱。所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱所 用的基 质为α -氰基-4-羟基肉桂酸，3，5- 二乙氧基-4-羟基肉桂酸，芥子酸，2，5_ 二羟基苯甲酸 或DNA自主装的金纳米颗粒中的任一种，优选DNA自主装的金纳米颗粒，特别优选以10 20个胸腺嘧啶或者腺嘌呤组成的DNA自组装的胶体金纳米颗粒。所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用AnchOrChipR400/384点样 靶，利用337nm波长的氮激光光源进行被测物的解析和离子化。所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用正离子反射模式，在10% 70 %的激光强度下进行检测，激光强度优选20 % 50 %，进一步优选20 % 35 %。所述的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱采用的加速电压为20 35KV，优 选 25KV。所述的纳米探针中的纳米材料为金纳米粒子，其粒径为10 lOOnm。所述的编码分子是分子中含有巯基或者二硫键的有机化合物，优选硫醇、硫醚或 二硫化物。所述的磁性微球可以是无机微球、生物高分子微球或聚合物高分子微球，优选聚 苯乙烯磁性微球。所述的磁性微球表面修饰有氨基或链霉亲和素。所述的夹心式复合物可通过磁力架分离。本发明的有益效果本发明是一种不需经过PCR扩增的基因检测方法，主要是通过提高胶体金纳米探 针表面编码分子和识别分子的比例，进行靶目标信号扩大，结合修饰过的磁性微球的浓缩 作用，以及与高灵敏度的现代化分析仪器相结合，从而实现不再需要PCR扩增靶目标的高 特异性、高灵敏度的基因检测。专利申请CN101281164A提出了利用双分子修饰的纳米探针与磁性捕获探针检测 基因或生物大分子的一个大方向，并未对其中影响灵敏度的具体条件进行研究，因此灵敏 度并不是很高，在用于基因检测时必须先借助PCR对靶基因进行扩增。发明人在前者的基 础上通过大量实验对影响灵敏度的因素进行了研究，确定了其具体条件，使检测灵敏度有 了显著的提高，即由原来的10_14M提高到10_17M。本发明不需要PCR扩增即可直接检测生物 大分子，从而避免PCR技术本身固有的可能出现“假阳性”，易于污染，技术操作要求高，繁 琐费时以及PCR过程需用酶具有的昂贵、易失活、不易保存等缺陷。本发明探针组装过程 简单、技术要求不高、可大批量制备、探针稳定性好易于保存；且杂交过程简单快速，易于操 作，质谱仪器分析自动化程度高等，这些优点有利于该方法的临床化，为临床疾病早期诊断 提供了一个新思路。理论上，利用有机分子作为质量条码的基因分析可以进行非常复杂的多重检测， 但目前的技术只能做到一重或两重靶目标的检测。多重检测对于许多分析方法都是一个十 分具有挑战性的问题，这是因为可能存在探针与非靶目标之间的非特异性结合、探针设计需要兼顾多方面考虑因素、测定时需要把待测物从探针-靶目标复合物中分离出来等许多 十分棘手且不可规避的问题。这些都要求分析方法不但要有高灵敏度，同时还要有高特异 性。然而一般情况下，分析测定方法的灵敏度与特异性是一对矛盾，往往需要根据方法的实 际需要，或者牺牲特异性而追求高灵敏度，或者牺牲灵敏度而追求高特异性。发明人经过大 量试验，在金纳米探针自组装过程中极大地提高了编码分子和识别分子的比例，使本发明 的检测灵敏度显著提高；在此基础上，在杂交时使用相对较高的盐离子浓度的反应体系，既 提高了杂交效率又不发生非特异性杂交，并且质谱测定过程中以DNA(10 20个胸腺嘧啶 或者腺嘌呤)自组装的胶体金粒子作为基质，几乎不存在其他方法存在的“本底”，使质谱 图更“干净”，确保该基因检测方法具备高灵敏度的同时，还兼具了很高的特异性，为实现生 物样品的多重检测提供了有力的手段。
本方法对靶目标的检测是通过质谱检测胶体金纳米探针上组装的编码分子的分 子离子峰实现的。理论上编码分子与识别分子的比例越大，靶目标的信号放大效果越好，灵 敏度越高。但由于编码分子是脂溶性物质，其溶解介质为乙醇，组装过程中太多的乙醇会破 坏胶体金的稳定状态，使其聚集沉淀。专利申请CN101281164A仅是参考文献随机选择了一 个比例，未研究编码分子与识别分子的比例与检测灵敏度及探针稳定性的关系。本发明在 专利申请CN101281164A的基础上通过大量平行实验优化了金纳米粒子表面的编码分子和 识别分子的比例，在该比例范围内既提高了灵敏度，又保证了纳米探针的稳定性。在此比例 范围以外，要么灵敏度过低，要么探针组装失败。本发明使用磁性微球(magnetic microparticle,MMP)作为固相支持物，同时起到 分离纯化与富集浓缩的作用，也是本方法灵敏度大大提高的主要贡献者之一。磁珠的种类 很多，根据磁珠制备的材料不同，可分为无机微球、生物高分子微球、聚合物高分子微球等。 磁珠表面可以连接有多种活性基团。本发明中使用的磁性粒子是表面具有氨基或者链霉亲 和素的微球。综上所述，本方法具有高灵敏度、高特异性，操作简单快速等优点，可用于生物样 品中靶目标的直接检测以及多重靶目标的测定，也可进行基因中寡核苷酸多态性(SNP)的 不同分型及其他方面的基因检测。另外，借助双标记的胶体金纳米探针，针对质谱无法区分 的相同质量数而不同碱基排列顺序的核苷酸检测尤为有效。
图1.单个靶DNA检测的灵敏度实验结果a.为靶DNA浓度分别为0，10_17，10_15，10_13，IiT11M的样品的TOF MS检测结果质谱 图，m/z 869 ；b.为靶DNA浓度分别为0，IO"17,10_15，10_13，IiT11M的样品的TOF MS检测灵敏度的 柱状图，图中信号强度为考虑了测定过程中稀释或者浓缩倍数以及点样量的结果。图2.多重靶基因检测选择性实验结果图(一)a.空白实验，即加入30 μ L超纯水；b.体系中加入含HIV-1，HCV, HBV和TP四种靶DNA的样品液，其总浓度为10_1QM， 在 m/z 693，781，869 和 957 显示 4 个峰;c.体系中加入只含HGV(完全不匹配DNA)的样品液30 μ L，质谱测定无峰，表示无杂交产物生成。图3.多重靶基因检测选择性实验结果图(二)a至d依次为加入30 μ L分别含HIV-1，HBV, HCV和TP四种靶DNA的样品液的质 谱图，分别在m/z 693，781，869和957各显示相应的峰；e为加入含HIV-I和TP两种靶DNA 的样品液的质谱图，在m/z 693和957显示相应的峰；f为加入含HCV和HBV的两种靶DNA 的样品液的质谱图，在m/z 781和869显示相应的峰；g为加入含HIV-I，HBV和TP的3种 靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 693，781和957显示相应的峰；h为加入含HIV-I，HCV和 TP的3种靶DNA的样品液的质谱图，在m/z 693，869，和957显示相应的峰。 图4.多重靶基因检测灵敏度实验结果图a中从左至右依次为5种样品液(其中靶DNA总浓度分别为0，10_17，10_15，10_13， I(T11M)的质谱图；b 各样品液(其中靶 DNA 总浓度分别为 0，IO"17, IO"15,10,，I(T11M)的 MALDI TOFMS 检测灵敏度柱状图，每个浓度水平柱状图从左至右依次对应HIV、HBV、HCV、TP基因。每个 浓度水平分别平行实验3次。图中信号强度为考虑了测定过程中稀释或者浓缩倍数以及点 样量的结果。图5.实际生物样品的测定过程示意图。图6.实际生物样品靶目标检测灵敏度实验a生物样品中靶DNA浓度从左至右依次为0，4. 2fM，42fM，420fM和4. 2pM的测定质 谱图；b为对应的灵敏度实验的柱状图。图7.寡核苷酸多态性(SNP)分析a.加入靶目标DNAl的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNAl与捕获探针及纳米 探针完全匹配，经过杂交_去杂交过程后，反应体系呈红色，MS测定存在m/z 869 ([M+Na] +) 和 837([M+Na-S]+)。b.加入DNA2的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNA2存在SNP，与捕获探针及纳 米探针不匹配，反应体系呈无色，MS测定无峰。c.加入DNA3的反应体系，EP管颜色及质谱结果；DNA3存在SNP，与捕获探针及纳 米探针不匹配，反应体系呈无色，MS测定无峰。图8.对质量数相同但碱基排列顺序不同核苷酸的区分a含有DNAl和DNA4两个靶基因的样品的颜色反应及质谱检测结果图；b不含任何靶基因的样品的颜色反应及质谱检测结果图；c只含有DNAl的样品的颜色反应及质谱检测结果图；d只含有DNA4的样品的颜色反应及质谱检测结果图。
具体实施例方式本发明所有DNA其合成和纯化由上海英潍捷基公司完成，氯金酸(99. 9% )购自上 海久岳化学有限公司，SMPB购自美国Pierce生物技术有限公司，氨基化磁性微球购自上海 英潍捷基公司，超纯水(18. 2ΜΩ · cm)经过SartoriusArium 611体系纯化，整个实验均采 用布鲁克公司的质谱(Bruker MLtraflex III T0F/T0F Mass Spectrometer)进行测定。实施例1生物磁性纳米探针应用于HCV-DNA的MS测定
(I)HCV胶体金纳米探针(HCV-AuNPs)的制备①IOD HCV-DNA识别分子(5，GCA GTA CCA CAA GGC AAA AAA AAA A SH 3，，SEQID NO. 1)大约35 μ g,离心5min (5000rpm)，加超纯水200 μ L溶解，涡旋30s,混勻；②加入2mL胶体金(自己合成，13nm，透射电子显微镜镜测定)，轻轻振摇 24h (20rpm)，室温(25 °C )；③加入0. 3M NaCl，IOmM磷酸缓冲液(PB)，pH = 7. 0 (磷酸缓冲液1)，使体系中 NaCl浓度到0. 1M，轻轻振摇老化36h ；④加入五甘醇二硫分子，48 μ L (IOOmM乙醇溶液为溶剂)，继续轻轻振摇12h，即得 编码分子与识别分子的比例约为1600 1的胶体金纳米探针。4°C保存。⑤临用前，离心(12，00(^)2511^11，除去上清液，以0.IM NaCl，IOmM PB, pH7. 0 (磷 酸缓冲液2)分散，如此离心并洗涤3次，最终分散于磷酸缓冲液1中，浓度大约5ηΜ。(2) HCV 捕捉探针(HCV-MMPs)的制备磁性微球(上海英潍捷基公司，300 μ L，30mg/mL)用300 μ L 二甲亚砜(DMSO)洗 涤 3 次，然后分散于 SMPB (4-[p-maleimidophenyl]butyrate, 4-[ρ-苯基马来酰亚胺]-丁 酸，琥珀酰亚胺)的DMSO溶液(lmg/100 μ L)，涡旋30min，室温振摇12h，磁力架分离，再用 300 μ L DMSO 洗涤 3 次，用 300 μ L 0. 15Μ NaCl, 0. IM PB，pH7. 0 (磷酸缓冲液 3)洗涤 2 次。IOD 的HCV-DNA捕获分子(5，SHA AAA AM AAA GCA CCC TAT CAG 3，，SEQ IDNO. 2)， 大约33 μ g，溶于100 μ L超纯水，加入到上述DMSO洗涤好并且已经氨基活化的磁珠中，室温 振摇10h，用300 μ L磷酸缓冲液3洗涤3次；然后分散在磷酸缓冲液3中，加入72 μ M(IOD)， 100 μ L 的 Α13 钝化 DNA (5，SHA AAA AAA AAA 3，，SEQ ID NO. 3)，振摇 10h，用 300 μ L 0. 2Μ NaCiaOmM PB, ρΗ7. 2 (磷酸缓冲液 4)洗涤 2 次，最终分散于 2mL 0. 3M NaCl, IOmM PB, pH7.2(磷酸缓冲液5)中。(3)夹心结构形成30 μ L靶HCV-DNA(5，-GCC TTG TGG TAC TGC CTG ATA GGG TGC 3，，SEQ ID Ν0. 4) 加入到50 μ L HCV-MMPs中，再加入饱和氯化钠磷酸溶液(用磷酸缓冲液1配制，浓度大约为 6Μ，25°C )，使体系氯化钠浓度为0. 6M，水浴45°C温孵30min，IOmin振摇1次，室温静置3h， 用0. 65M NaCl，IOmM PB, pH7. 0 (磷酸缓冲液6)洗涤3次，100 μ L/次，最终用50 μ L磷酸 缓冲液6分散。加入50 μ L HCV-AuNPs,再加入饱和氯化钠磷酸溶液，使体系氯化钠浓度为 0. 62M，室温静置3h，30min振摇1次，用磷酸缓冲液6洗涤7次，200 μ L/次，最终用10 μ L 超纯水分散。75°C水浴温孵5min，去杂交，磁力架分离，质谱测定。(4)质谱测定以15个单位的腺嘌呤(A15)自组装的胶体金颗粒作为基质，易于测定，质谱更“干 净”。离子源1和离子源2的加速电压分别为25kV和21. 55kV，线性正离子扫描模式，棱镜 的加速电压为9. 5kV，反射元件1和反射元件2的加速电压分别为26. 3kV和13. 85kV，一般 情况下使用30%的最适激光强度测定。把2 μ L的去杂交产物点靶于MALDI TOF MS测定的 专用靶(Anchor-Chips，400/385)上。主要检测编码分子的加钠分子离子峰([M+Na]+)。质 谱检测HCV-DNA靶DNA时，检测限可达到10aM(10_17M)水平，见图1。实施例2基于生物磁性纳米探针对靶DNA (HIV-1，HBV, HCV和TP)混合液的多重测 定本实施例中所涉及的DNA链序列见表1 :
表 权利要求
一种基因检测方法，包含如下步骤利用修饰有识别分子和编码分子的纳米粒子为纳米探针及修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，分离出该夹心式复合物，释放出纳米探针，通过质谱直接检测纳米探针表面编码分子的分子离子峰，其特征在于纳米探针中编码分子与识别分子的比例为300～2000∶1，优选1300～2000∶1。
2.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的形成夹心式复合物的杂交 反应体系的盐离子浓度为0. 2 1. 0M，优选0. 5 0. 7M。
3.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的质谱为基质辅助激光解析 离子化飞行时间质谱或电喷雾质谱，优选基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱。
4.根据权利要求3所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化 飞行时间质谱所用的基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸，3，5_ 二乙氧基-4-羟基肉桂酸，芥子 酸，2，5- 二羟基苯甲酸或DNA自主装的金纳米颗粒中的任一种。
5.根据权利要求4所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化 飞行时间质谱所用的基质为DNA自主装的金纳米颗粒，优选以10 20个胸腺嘧啶或者腺 嘌呤组成的DNA自组装的胶体金纳米颗粒。
6.根据权利要求3所述的基因检测方法，其特征在于所述的基质辅助激光解析离子化 飞行时间质谱采用正离子反射模式，在10% 70%的激光强度下进行检测。
7.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的纳米粒子为胶体金纳米粒 子，其粒径为1 lOOnm。
8.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的编码分子是分子中含有巯 基或者二硫键的有机化合物，优选硫醇、硫醚或二硫化物。
9.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征在于所述的磁性微球可以是无机微 球、生物高分子微球或聚合物高分子微球，优选聚苯乙烯磁性微球。
10.根据权利要求1或9所述的基因检测方法，其特征在于所述的磁性微球表面修饰有 氨基或链霉亲和素。
全文摘要
本发明属于分子诊断领域，公开了一种无需借助PCR的基因检测方法。该方法包含如下步骤利用修饰有识别分子和编码分子的纳米探针及修饰有捕获分子的磁性微球为捕获探针与靶基因形成夹心式复合物，通过洗涤用磁力架分离出该夹心式复合物，去杂交释放出纳米探针，通过基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱直接检测纳米探针表面的编码分子的加钠分子离子峰，其中纳米探针中编码分子与识别分子的比例为300～2000∶1。本方法最大的优势在于高灵敏度、高选择性，可用于生物样品中目标基因的直接检测。此外，本发明还具有操作简便、速度快、自动化程度高等优点，为疾病早期诊断或其他基因检测提供了新的有力手段。
文档编号G01N27/62GK101967517SQ201010147160
公开日2011年2月9日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者黄乐群 申请人:黄乐群