抗ca242单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备方法
【专利摘要】抗CA242单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别CA242的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测CA242的高灵敏度的方法；还提供了CA242化学发光免疫分析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括：CA242检测反应板、酶结合物、发光底物、标准品、质控品、浓缩洗涤液。本发明用细胞融合和杂交瘤技术研发出灵敏度高、特异性好的抗体；同时用自主研发抗体将免疫学与化学发光技术相结合，研制出检测范围宽、灵敏度高、操作方便、生产成本低的试剂盒。本试剂盒通过体外测定血清中CA242的浓度，用于肿瘤的辅助诊断、对确诊的恶性肿瘤患者进行动态监测以辅助判断疾病的进程等。
【专利说明】抗CA242单克隆抗体产生的杂交瘤及化学发光免疫分析试剂盒的制备
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及CA242单克隆抗体产生的杂交瘤及检测血清中CA242含量的试剂盒，可广泛应用在医学和及生物化学【技术领域】。
[0002]【背景知识】
[0003]CA242抗原是一种新的糖类肿瘤标志物，在恶性肿瘤患者血清中CA242都有较高的阳性检出率。正常人体胆管细胞、胰管细胞中含少量CA242。但CA242主要存在于胰腺和结肠的恶性肿瘤细胞中，胰腺肿瘤细胞CA242免疫荧光明显强于邻近正常胰腺细胞。CA242对胰腺癌和直肠癌是一种有价值的新的肿瘤标志物。但CA242对肝癌和胃癌的诊断率较低。至今也没有一种标志物能对某种肿瘤完全特异，所以仅仅通过某一种单项肿瘤标志物检测诊断肿瘤的准确率较低，不能广泛应用于肿瘤的早期检测，但是有研究表明，采用多种肿瘤标志物的联合检测,可以弥补上述不足。如同其他肿瘤标志物CEA、CA199、CA50、CA125等联合应用，有助于提高阳性诊断率，减少临床的漏诊率。
[0004]临床研究表明，在胰腺癌及晚期结直肠癌患者血清中，CA242普遍有显著的升高，对结直肠癌而言，CA242显示出比CA50及CA199具有更高的灵敏性；在CA50的对照研究中显示，对于Dukes各期肿瘤的检测均有更高的灵敏性，且随临床病期的进展而显著增高。用高亲和力的CA242单克隆抗体检测血清中的CA242，其原理基于C242可与粘蛋白表面的抗原CA242特异性结合，经标记后利用免疫血清学方法检测，这比以往检测CA199及CA50特异性更高。
[0005]CA242作为胰腺癌和结直肠癌相关的肿瘤标志物，在临床诊断、监测及手术预后方面的作用十分突出。它的检测方法简便可行，因此在临床上具有很好的应用价值。同时，CA242可作为一种肿瘤标志物协助多种恶性肿瘤的诊断、指导治疗以及判断预后。
【
【发明内容】
】
[0006]本发明的目的在于提供一种抗CA242单克隆抗体产生的杂交瘤以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CA242的方法，并将该方法应用胰腺癌和结直肠癌的早期筛查。以解决现有的单克隆抗体检测CA242的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种CA242化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。
[0008]本发明获得了能够产生特异性识别CA242的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4-1与杂交瘤细胞株4-5，此2株细胞株分别在2014年I月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址 是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:C201419与CCTCC N0:C201420。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别CA242的两个不同表位，通过4-1与4-5的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。[0009]因此，本发明提供了下面所述的I至7的内容:
[0010]1.抗CA242的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC N0:C201419和CCTCCN0:C201420o
[0011]2.抗CA242的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC N0:C201419和CCTCCN0:C201420的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为4-1和4_5。
[0012]3.如权利要求2所述的抗CA242单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA242，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCCN0:C201419杂交瘤分泌的抗体4-1和保藏号为CCTCC N0:C201420杂交瘤分泌的抗体4_5，其步骤包括:
[0013](I)以所述的两两配对的单克隆抗体4-1包被；
[0014](2)加入待测样品孵育；
[0015](3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体4-5作为二抗，加入反应体系;
[0016](4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
[0017](5)结果表明检测的灵敏度很高。
[0018]4.一种检测血清中CA242含量的试剂盒，包括:包被有抗CA242单克隆抗体4_1的不透明聚苯乙烯板；CA242抗原系列标准品；酶标记的CA242单克隆抗体4_5 ;上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。
[0019]5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体4-1，包被液是磷酸盐缓冲液；另一株CA242单克隆抗体4-5和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体，采用的是改良的过碘酸钠法进行标记；CA242抗原系列标准品以小牛血清为基质，加入CA242抗原纯品配置而成；发光底物A、B为HRP-Luminol发光体
系O
[0020]6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶，用的是高碘酸钠氧化法，所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1:3000 ;包被有抗CA242抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；发光液A液用硼砂7.99g，硼酸
3.46g，鲁米诺0.28g，对碘苯酚0.07g，加工艺用水定容至700mL，避光保存；发光底物B液由下列成分组成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。
[0021]7.如权利要求4-6所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤:
[0022]( I)标准品的配制和浓度的校正
[0023]将CA242抗原纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成O、10、25、50、100、200U/mL的系列标准品，标准品用国家标准品校正。
[0024](2)包被
[0025]采用0.5mol/L, pH值为9.5的碳酸盐缓冲液与CA242单抗混合成抗体浓度是3 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上,4°C孵育过夜；
[0026](3)洗板
[0027]用PBS-T洗液洗板孔2次；
[0028](4)封闭[0029]封闭液包含NaC18.00g,KC10.20g,Na2HPO4.12H202.90g,KH2PO40.20g，蔗糖 20.0Og,proclin3001.0OmL, BSA20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150 μ L/孔封闭，湿盒放置孵育3h ；
[0030](5)干燥
[0031]去除封闭液，过夜干燥。
[0032](6)组装为成品
[0033]将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。
[0034]上述的抗CA242的单克隆抗体，是由下列的方法所制备，步骤包括:
[0035](I)用蛋白量为2.5KU的CA242抗原与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合；
[0036](2)将免疫小白鼠脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1-10:1的比例，用50%PEG作为融合剂融合；
[0037](3)用含HAT (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的无血清培养基，在37°C，5%C02的细胞培养箱中培养10天，常规间接ELISA方法筛选阳性孔；
[0038](4)筛选出的特异性强阳性孔用有限稀释法克隆，获得单抗细胞株进一步扩大培养;
[0039](5)收集培养上清液，亲和层析法纯化单克隆抗体，即为抗CA242单克隆抗体；
[0040](6)检测单克隆抗体的效价，选取效价高的一株进行HRP标记，并对标记好的单克隆抗体进行滴度测定；
[0041](7)标记好的单克隆抗体与其他未标记的单克隆抗体进行竞争ELISA反应，选取没有竞争的一株进行夹心ELISA反应，确定最佳条件。
[0042]本发明的单克隆抗体可直接用于检测样品中的CA242含量，通过大量培养单抗细胞株，即可获得大量的单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强、重复性好等优点。
[0043]本发明针对临床实验室建立了一种既可以手工操作，又可以用于标准全自动检测仪器的检测手段，建立了检测人血清CA242的定量检测方法。本发明的CA242定量检测试剂盒(化学发光法)可以专一的检测出人血清中的CA242的含量，从而根据其含量的多少判断胰腺癌或结直肠癌病情的变化和治疗效果。它具有简便、快速、灵敏、稳定的优点，本发明的试剂盒，包被的抗体4-1与酶标记的抗体4-5及被测样品中的CA242形成“包被抗体-抗原-抗体-酶”的夹心复合物结构，所以本发明采用的是“双抗夹心一步法”的反应模式。利用辣根过氧化酶催化发光底物，发光底物发生化学反应释放大量的能量，产生激发态的中间体，当其回到稳定的基态时，可以发射出光子，利用发光仪器测量光量子的产额，该光量子的产额和样品中的检测物质的量成正比，由此建立标准曲线并计算出样品中待测物质的含量。试剂盒检测方法具有灵敏度高，检测范围宽，操作方便、对实验人员无伤害，同时生产成本低，减轻了医患双方的负担，因此更有利于临床胰腺癌和结直肠癌的早期筛查。
【【专利附图】
【附图说明】】[0044]图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗CA242单克隆抗体在ELISA方法中效价测定结果；
[0045]图2显示的是标记HRP的抗CA242单克隆抗体滴度测量结果；
[0046]图3显示的是夹心法ELISA系统的检测灵敏度；
[0047]图4显示的是所制备的试剂盒的标准品线形图。
【【具体实施方式】】
[0048]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
[0049]实施例1:动物免疫
[0050]选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为15KU的CA242抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合。 [0051]实施例2:杂交瘤的构建
[0052]1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
[0053](I)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12h。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期);
[0054](2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加IOmL的培养基，吸取少量10倍稀释后，计数。
[0055]2、脾细胞的制备
[0056]( I)将小鼠放在密封袋中，充CO2使其窒息死亡；
[0057](2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加IOmL的红细胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加IOmL的培养基，吸取少量10倍稀释后，计数。
[0058]3、细胞融合
[0059]细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1:10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为4-1和4-5。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5%C02的培养箱中封闭培养12天。
[0060]实施例3:单克隆抗体的制备及筛选
[0061]1、单克隆抗体的制备
[0062]从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与抗原多肽反应的单克隆抗体。[0063]2、单克隆抗体的筛选
[0064](I)将IOOuL浓度为10U/ml的CA242到96孔板的每个孔格中，于4 °C过夜后使其
固定于固相；
[0065](2)用150uL浓度为1%的牛血清白蛋白进行封闭2h ；
[0066](3)将IOOuL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37°C反应2h，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37°C反应Ih ；
[0067](4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min ；
[0068](5)添加50uL浓度为0.2N的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；
[0069](6)选出吸光度大约为3的4-1和4-5，并通过有限稀释法进行亚克隆。
[0070]3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
[0071]将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为4_1与4_5。
[0072]4、单克隆抗体效价的测定
[0073]所筛选出的2株单克隆抗体的效价通过ELISA方法来测定。分别加入4_1、4_5(10ug/mL)，在反应后 ，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，结果如图1所示两株单克隆抗体的效价达到10-9以上。
[0074]实施例4:单克隆抗体的标记及滴度的测定
[0075]将纯化出的抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为10U/mL的CA242固定在96孔微板上(IOOuL/孔)。使用1%的牛血清白蛋白进行封闭2h，加标记的单克隆抗体(第一孔100倍稀释)，从第二孔开始4倍稀释，于室温下反应lh。添加TMB后，反应在室温下进行20min，用0.2N的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，HRP标记的单克隆抗体的滴度结果如图2所示。
[0076]实施例5:双抗体夹心ELISA检测CA242方法的建立
[0077](I)以所述的两两配对的单克隆抗体4-1包被，3ug/ml的单克隆抗体以IOOuL/孔加到微孔板上，于4°C孵育24h固定于固相；
[0078](2)微孔板使用含有0.l%Tween-20的pH值为?.4的20mM PBS以200uL/孔的量洗2次。以150uL/孔的量加入1%牛血清白蛋白进行封闭2h。
[0079](3)微孔板用PBST以200uL/孔的量洗4次，加入由起始浓度10ug/ml连续4倍稀释CA242，于室温温育2h，然后加入标记HRP的另一株抗体4_5 (1:3000 ;IOOuL/孔)并于
室温温育2h。
[0080](4)添加TMB后，反应在室温下进行20min，加入0.2N的硫酸中止反应并测量450nm的吸光度。
[0081](5)检测结果见附图3所示。
[0082]实施例6:制备本发明的CA242定量测定试剂盒(化学发光法)
[0083](一)高碘酸钠氧化法标记辣根过氧化酶
[0084]( I)酶的氧化(全过程避光)
[0085]称取3-5mg HRP 溶解于 600 μ L ddH202 中；
[0086]b、加入新鲜配制的 150uL0.1M 高碘酸钠(NaIO4) (MW:213.89g/mol，取 0.22g 溶解于IOmLlOmM pH7.0磷酸钠缓冲液中)；[0087]C、混匀，室温，避光孵育20min ;
[0088]d、将溶液用透析管透析,3000rpm/min,4°C, 20min,溶液为1.0mM pH4.0醋酸钠缓冲液，换3-4次；
[0089]e、最后透析至800 μ L,至EP管中；
[0090](2)抗体的准备和标记(避光)
[0091]a、取准备好的3mg单抗，用离心管浓缩成500 μ L-1000 μ L体积，吸出于新的15mL离心管中；
[0092]b、加入500 μ L0.2Μ ρΗ9.5碳酸盐缓冲液，混匀，检测pH值在9.0~9.5 ;
[0093]C、立即将透析好的HRP溶液与单抗溶液混合，室温摇晃2h，避光；
[0094]d、加入 80 μ L 新鲜配制的 NaBH4 (4.0mg/mL,取 40mg 溶解于 IOmL ddH202 中)；
[0095]e、混匀(避光)，4°C孵育 1.5h ;
[0096]f、用PBS透析至体积为2mL ；
[0097]g、加入等体积甘油，ImL/管，_20°C保存
[0098](二)酶标抗体工作液的配制
[0099](I)酶标稀释液的配制
[0100]
【权利要求】
1.抗CA242的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCN0:C201419和CCTCCN0:C201420o
2.抗CA242的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO:C201419和CCTCC N0:C201420的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为4-1和4-5。
3.如权利要求2所述的抗CA242单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CA242，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC N0:C201419杂交瘤分泌的抗体4-1和保藏号为CCTCC N0:C201420杂交瘤分泌的抗体4_5，其步骤包括: (1）以所述的两两配对的单克隆抗体4-1包被； (2)加入待测样品孵育； (3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体4-5作为二抗，加入反应体系； (4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值； (5)结果表明检测的灵敏度很高。
4.一种检测血清中CA242含量的试剂盒，包括:包被有抗CA242单克隆抗体4_1的不透明聚苯乙烯板；CA242抗原系列标准品；酶标记的CA242单克隆抗体4_5 ;上述酶所作用的化学发光底物A液和B液以及洗涤液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被单克隆抗体4-1，包被液是磷酸盐缓冲液；另一株CA242单克隆抗体4-5和辣根过氧化酶偶联形成酶标记抗体，采用的是改良的过碘酸钠法进行标记；CA242抗原系列标准品以小牛血清为基质，加入CA242抗原纯品配置而成；发光底物A、B为HRP-Luminol发光体系。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:标记抗体所用的标记酶是辣根过氧化酶，用的是高碘酸钠氧化法，所得酶标记抗体最佳的工作浓度是1:3000 ;包被有抗CA242抗体的不透明聚苯乙烯板采用的是直接物理吸附法包被；发光液A液用硼砂7.99g，硼酸3.46g，鲁米诺0.28g，对碘苯酚0.07g，加工艺用水定容至700mL，避光保存；发光底物B液由下列成分组成:硼砂7.99g,硼酸3.46g,过氧化脲0.07g加工艺用水定容至700mL。
7.如权利要求4-6所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤: (1)标准品的配制和浓度的校正 将CA242抗原纯品，加入标准品稀释液，配制一高浓度标准品浓液，采用逐低稀释的方法稀释到各浓度，配制成O、10、25、50、100、200U/mL的系列标准品，标准品用国家标准品校正。 (2)包被 采用0.5mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液与CA242单抗混合成抗体浓度是3 μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育过夜； (3)洗板 用PBS-T洗液洗板孔2次； (4)封闭
封闭液包含 NaC18.00g, KC10.20g, Na2HPO4.12H202.90g, KH2PO40.20g,蔗糖 20.0Og,proclin3001.0OmL, BSA20.00g，封闭液的PH值为7.3-7.5，150 μ L/孔封闭，湿盒放置孵育3h ； (5)干燥去除封闭液，过夜干燥。(6)组装为成品将聚苯乙烯板子放入铝箔袋中并放入干燥剂，密封保存。
【文档编号】G01N33/577GK103789271SQ201410035829
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】李玉花, 蓝兴国, 张兰兰, 魏德强, 张天沛 申请人:东北林业大学, 东北林业大学大庆生物技术研究院, 李玉花