一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法
【专利摘要】一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，属于生物检测【技术领域】，方法是：利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列,将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达，纯化了对βG具有特异结合性的蛋白质。有益效果是：具有成本低、快速、灵敏度高等特点。将来可广泛应用在食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域。本发明利用比浊法对β-葡聚糖进行测定，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
【专利说明】一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]β -葡聚糖其来源于新鲜的食品啤酒酵母、燕麦、食用菌类等。根据糖键结构差异可分β - (I — 3)-葡聚糖和β - (I — 6)-葡聚糖，β-葡聚糖的活性结构是有葡萄糖单位组成的多聚糖，她能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球等，从而提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。此外，葡聚糖还有清楚游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等感染等作用，固广泛用于医药、食品、化妆品等行业。葡聚糖还具有治疗肿瘤、肝炎、心血管、糖尿病和降血脂、抗衰老等方面有独特的生物活性。因此检测葡聚糖在食品领域和化妆品领域都有很广阔的空间。
[0003]真菌的细胞壁主要成分为(1，3)-0-0葡聚糖(06)。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，β G可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中葡聚糖含量增高。对β G进行测定，实现真菌感染早期诊断及早期治疗，是改善患者愈后，提尚患者生存质量的关键。
[0004]国内外用于检测β -葡聚糖的方法如下:
1.粘度法:原理是大麦抽提液粘度主要由葡聚糖产生，但葡聚糖粘度同时与含量和分子量有关，分子量越大，粘度越大，因此该法测定结果误差很大。
[0005]2.沉淀法:原理是利用特定盐或有机溶剂沉淀抽提液中价葡聚糖；该方法局限性在于抽提不能完全排除其它物质干扰。
[0006]3.酶法:此方法采用特定葡聚糖内切酶得到寡糖，经酸解后采用葡萄糖氧化酶/过氧化酶试剂测定葡萄糖含量，双酶法有较高的专一性和准确性，是目前国际上较通用的测定方法，缺点是测定时间长，试剂盒单价高，试剂保存时间短。
[0007]4.刚果红:用于测定啤酒中f3G含量，能和多种聚合糖发生作用，形成颜色浓郁的多聚糖-刚果红络合物。但测定的结果过低，可能是供试品中0G分子被其他分子包裹未能充分溶解，使显色不足，故不适于测定固态供试品中βG含量。
[0008]5.荧光法:主要是利用荧光物质可与葡聚糖特异性结合，而与其它多糖和纤维素、戊聚糖亲和力很弱这一特性进行测定，此法在一些啤酒企业中使用。
[0009]6.苯酚-硫酸法:测定结果与供试品的已知含量有相当大的差别，可能因为多糖和寡糖被浓硫酸水解成单糖，并通过苯酸显色，对0G无专一"性。
[0010]7.鲎试剂法:测定微量β -葡聚糖的方法就是利用鲎试剂(鲎的血细胞提取物)，原理:G因子是丝氨酸蛋白酶前体，通过结合β G而被活化，从而启动G因子系统的蛋白酶级联。并且被活化的G因子使凝固酶前体被活化，最终生成凝胶。将含鲎血细胞提取物的试剂与含β G的血液样品混合，测定该混合液在光照射开始之后达到规定值所需的时间，将所得的该时间代入使用浓度已知的βG溶液预先制成的表示凝胶化时间与βG浓度的关系的标准曲线中，求出样品中的β G浓度，对患者做出真菌感染的检测。虽然这种检测方法灵敏度很高，但是鲎血源于天然材料，必将会担心资源的枯竭，鲎现已经列入某些地区的二级保护动物，因此鲎试剂的成本比较高，还需要对样品进行前处理，测定时间长。
[0011]因此，现今国内外对β G浓度的测定方法都不是很理想，有些方法存在稳定性差、特异性差、价格昂贵、灵敏性差、检测时间长等缺点，本专利发明了对β G的新型测定方法，为将来的食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域提供技术基础，满足现代生物检测各领域日益增长的需求。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是:提供一种特异性蛋白检测葡聚糖的比浊法，它能够低成本高敏度特异性地测定β Ge
[0013]本发明的方法是:利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列，将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达，纯化了对βG具有特异结合性的蛋白质。
[0014]表达蛋白可以与葡聚糖特异性结合，形成一定结构的复合物，在促聚剂聚乙二醇作用下，成为悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于复合物的吸收其吸光值增大，故在一定范围内吸收度与复合物量呈正相关；当蛋白质浓度固定时，样品的浊度与其中所含0G量成正比，绘制标准曲线，从而达到未知0G的测定。
[0015]采用粒径为180nm的大颗粒聚乙二醇微乳颗粒，具有较大的粒径，增加血液中β G和蛋白反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间，可以在570nm的波长下进行检测；用固定的蛋白质浓度测定不同0G量，测出吸光值，绘制曲线，得到一定范围内的标准曲线，可以求出未知0G的量。
[0016]序列表
序列I 1251bp DNA美洲鲎属
aat aca cct tct cct gtt gac gtt act cat tta tct ggt tac tat ttt 48
Asn Thr Pro Ser Pro Val Asp Val Thr His Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe
151015
ctt caa aat agg cac agt gaa ctg tat ctt gat gtc agt ggt tcc agt 96
Leu Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu Asp Val Ser Gly Ser Ser
202530
aac gaa gat gga gca ttt cta caa caa tgg cct tat age ggt aat get 144
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354045
aac caa cag ttt gat ttt gta cat ctc gga aat aag gtt tat aaa att 192
Asn Gln Gln Phe Asp Phe Val His Leu Gly Asn Lys Val Tyr Lys lie
505560
ate aat aaa aat agt gga aaa tct ctg gat gtt tac gag tta ggg act 240
lie Asn Lys Asn Ser Gly Lys Ser Leu Asp Val Tyr Glu Leu Gly Thr65707580
gat aat ggt gtc aga ate caa cag tgg tcg tat gga gggggctacaat 288
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859095
cag cag ttt att gta caa gat gtt gga gat ggt tat tataagatattt 336
Gln Gln Phe lie Val Gln Asp Val Gly Asp Gly Tyr TyrLysliePhe
100 105110
gca cgc age act gga aag tta gtg gaa gta gca gat ttgaataaagac 384
Ala Arg Ser Thr Gly Lys Leu Val Glu Val Ala Asp LeuAsnLysAsp
115 120 125
cca gga gga aag ata caa caa tgg tct gat gat ggc caattatccgga 432
Pro Gly Gly Lys lie Gln Gln Trp Ser Asp Asp Gly GlnLeuSerGly
130 135 140
cag tgg aaa ctt att cga aat aaa get aat tct aaa ttgattcaggca 480
Gln Trp Lys Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Lys LeulieGlnAla
145150155160
gaa agt tat ttt get agt tea aaa gta caa ttg gaa gatacctcggat 528
Glu Ser Tyr Phe Ala Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu AspThrSerAsp
165170175
gta gga ggc ggg aag aat gtc aag tgt gat aat gaa ggagcctggatg 576
Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu GlyAlaTrpMet
180 185190
get tac aag gat ate aat ttc cca agt tea ggt act tatcaagtagag 624
Ala Tyr Lys Asp lie Asn Phe Pro Ser Ser Gly Thr TyrGlnValGlu
195 200 205
tac aga gtg gca agt gaa cgt gca gga gga atg ttg tctctggatttg 672
Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Met Leu SerLeuAspLeu
210 215 220
aat gca ggt tct ata gtg ctt ggc atg ctg aat gtt cctteaactgga 720
Asn Ala Gly Ser lie Val Leu Gly Met Leu Asn Val ProSerThrGly
225230235240
gga ttg cag aag tgg acc acc att tcc cac aca gtg aatgtaagttea 768
Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr lie Ser His Thr Val AsnValSerSer
245250255
ggt acg tac aac ttg ggg ate agt gtt caa cga ccc gggtggaatate 816
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260 265270
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Asn Trp lie Asn lie Thr Lys Val Ser Ser Gln Leu LysSerliePro 275280285
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Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val
305310315320
aag tgt gat act aaa gga gcc tgg atg gcc tac aag gat ate aat ttt 1008
Lys Cys Asp Thr Lys Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp lie Asn Phe
325330335
ccc agt tea ggt agt tat caa ata gag tac aga gtg gca agt gaa cgt 1056
Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Gln lie Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg
340345350
gca gga gga aag ttg tct ctc gat ttg aat gca ggt tct ata gtg ctt 1104
Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser lie Val Leu
355360365
gga atg ctg gat gtt cct tea act ggg gga tgg cag aag tgg acc acc 1152
Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly Trp Gln Lys Trp Thr Thr
370375380
att tcc cat aca gta aag gtg gat tea ggt act tat aac ttg ggg ate 1200
lie Ser His Thr Val Lys Val Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly lie
385390395
tac gtt caa caa ccc ggg tgg aat ate aac tgg att aag att aca aag 1248
Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn lie Asn Trp lie Lys lie Thr Lys
405410415
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本发明的有益效果是:具有成本低、快速、灵敏度高等特点。将来可广泛应用在食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域。本专利利用比浊法对β-葡聚糖进行测定，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。
[0017]成本低:本专利利用自己表达的蛋白，弥补了酶法试剂盒单价高，试剂保存时间短的特点，无需利用天然材料鲎试剂，现已列入二级保护动物，而担心资源枯竭，成本高的不足。
[0018]快速:实验简便，结果回报时间短只需10分钟，便于及时反馈信息，可节约大量人力物力，有利于大批量样品的处理。可以利用测光仪进行快速检测，待测物用量少，具有明显的应用优势。改进了其它方法在测定时复杂过程，反应比较慢的缺点。
[0019]高灵敏:稳定性好，此免疫比浊法可以检测β G的下限为6Pg/ml，精确度高，干扰因素少，结果判断更加客观、准确。可以代替误差较大的粘度法，抗干扰性不强的沉淀法，使用有局限的刚果红法，检测不灵敏的荧光法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是目的片段PCR体系表；
图2是回收片段和pUCm-T载体连接反应体系；
图3是pUCm-T-FVO和PET_15b载体的双酶切反应体系表；
图4是目的基因片段和PET-15b线性载体连接反应体系；
图5是目的蛋白通过Ni柱逐步纯化图；
图6是比浊法在一定范围内测βG的标准曲线。
[0021]具体的实施方式
1.目的基因的PCR扩增
在GENBANK中找到目的片段美洲鲎属G因子α亚基的片段a (FVO) (GenBank:AB547712.1)，如序列I所示，由上海生物工程公司人工合成其基因，大小是1251bp，合成为JM109-pMD19-T Simple-FVO的工程菌，以重组质粒为模板，采用PCR技术克隆此FVO片段。
[0022]引物序列
引物 F 5'-CATATGAATACACCTTCTCCTGTTGACG-3'
引物 R 5'-GGATCCTGTAACCTTTGT-3'
PCR的反应条件:在98°C加热2分钟之后，将95°C 15s、50°C 30s,68°C 2min重复30次，最后68 °C 5min。反应体系如图3所示。
[0023]2.重组质粒的连接与鉴定
将所得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切下1.2Kbp附近的凝胶，用DNA胶回收试剂盒(Sangon)进行目的基因片段的回收。从切下的凝胶中纯化PCR产物。回收片段和pUCm-T载体连接，建重组质粒pUCm-T-FVO，如图4所示在22°C连接16h。
[0024]大肠杆菌DH5a感受态的制备
I)将_80°C冻存的大肠杆菌DH5a在不含抗生素的LB琼脂固体培养基划线，37°C培养16小时。
[0025]2)从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于1ml LB培养液的试管中，37°C振荡培养过夜。
[0026]3)取ΙΟΟμΙ菌液转接到一个含有1ml LB培养液锥形瓶中，37°C振荡培养3小时左右，培养至OD6qq=0.4-0.6ο
[0027]4)用灭菌的枪头取Iml的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置10分钟后，4°C，4000rpm离心10分钟，去上清，加入0.2mL预冷的0.lmol/L的CaCl2溶液。在旋涡震荡器上震荡I分钟，使细胞充分混悬。冰浴30分钟后，4°C，4000rpm离心10分钟，去上清，加入0.1ml预冷的0.lmol/L的CaCl2溶液。
[0028]5)将1.5ml离心管放在冰上，每管含0.1ml感受态细胞，细胞可以立即使用。
[0029]6)将余下部分感受态细胞迅速转移到_80°C低温冰箱中，备用。
[0030]pUCm-T-FV0转化到大肠杆菌DH5a
I)取新鲜制备的ΙΟΟμΙ感受态细胞，将细胞均匀悬浮后置于冰上。
[0031 ] 2)加入10μ1 pUCm-T-FV0的质粒，冰上放置30分钟。
[0032]3) 42 °C水浴热激90秒，迅速放置冰上2分钟。
[0033]4)加600μ1 37°C预热的LB培养液，37°C，80rpm振荡培养15分钟；在120rpm振荡培养15分钟；在150rpm振荡培养30分钟。
[0034]5)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μ1上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
[0035]6)将悬浮菌液涂布预先涂布在含有40μ1 2% X-gal和4μ1 20% IPTG及10Pg/mL Amp的LB琼脂平板上。
[0036]7)平皿在37°C下正向放置至菌液吸收进琼脂后，将平皿倒置，过夜培养14_16h，进行蓝白班筛选。单克隆子的鉴定，选择泳动明显较慢的单克隆子，送完上海生工有限公司进行序列测定。将测序结果为阳性的单克隆子含有的重组质粒命名为pUCm-T-FVO。
[0037]3.重组表达质粒的连接和鉴定
对实验室保存的PET-15b质粒和构建好的重组质粒pUCm-T-FVO进行双酶切，如图5所示放置37°C，时间3h。
[0038]构建FVO基因与PET_15b质粒上的IacZ promoter顺向连接的重组质粒PET-15b-FV0o保温3h后，取5μ1双酶切反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，看基因片段是否酶切完全，目的基因条带是否清楚，用DNA胶回收试剂盒(Sangon)进行目的基因片段的回收。
[0039]将纯化的pUCm-T-FV0基因片段立即与PET_15b线性载体进行连接，反应体系如图6所示，在22 °C连接16h。
[0040]大肠杆菌DH5a感受态的制备和pET-15b_FV0转化到大肠杆菌DH5a如方法(2)仅是6)将200μ1细菌涂布在lOOPg/ mL Amp的LB琼脂平板上。
[0041]7)平皿在37°C下正向放置I小时，待涂布的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，过夜培养16小时。
[0042]方法同上配置B121感受态，将构建的表达质粒pET-15b-FV0导入。
[0043]4.重组蛋白的表达和分离纯化
将BL21-pET-15b-FV0菌按体积比1:50到LB(Ampl0(^g/ ml)液体培养液中活化37°C，180 rpm过夜，次日转接培养的菌液按体积比1:20到LB (AmplOOPg/ ml)液体培养液中扩大，37°C，180 rpm培养至OD6tltl约为0.8(约在4小时)，加入IPTG至终浓度为ImM，继续培养48小时，培养后，将培养液进行离心分离，回收所得的沉淀物(菌体)。将沉淀物用PBS洗涤，然后放一定量的溶菌酶，反复冻融，进行超声破碎，工作参数:工作10s，间歇9s，功率200W，循环30次。10000rpm，4°C离心lOmin。过柱纯化前将样品溶液分别用0.22Mm孔径滤膜过滤。过Ni柱，依据附带的说明书记载的方法进行利用N1-琼脂糖的亲和纯化，从上述所得的上清组分中纯化目的蛋白，经过透析去除多余的咪唑，浓缩，收集每步样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果示于图1，目的蛋白的分子量约为40kDa。
[0044]5.将蛋白与聚乙二醇偶联将纯化好的目的蛋白与羧基微球偶联
O取一定量180nm的微球，用0.02M的MES溶液调整到15mg/ml，混匀；
2)逐滴加入10mg/mlEDC溶液，边加入边混匀，终浓度0.lmg/ml，37°C旋转混匀(或室温混匀)，反应25分钟后，取下离心20分钟；
3)沉淀悬浮在0.05M PBS溶液中，超声确保微球均匀分散； 4)逐滴加入抗体边加入边混匀，通常抗体的包被比为1mg微球:1-1.5mg抗体；
5)37°C反应3小时后加入浓度为lOOmg/mlBSA溶液，终浓度3mg/ml ；
6)I小时候后加入IM甘氨酸溶液，终浓度0.05M,室温反应过夜即可。
[0045] 6.免疫比浊法
做四组一样的样品进行测定，0G标准品20(^g/ml，将β G按体积梯度稀释，向96孔板内加入(50μ1)，再加入lOOPg/ml (ΙΟΟμΙ)的特异性蛋白质，混匀，反应5分钟，以蒸馏水代替β G的样品进行测定，作为空白值，在570nm的波长下进行测定，每组数据的吸光值是实际吸光度值减去空白值，以β G浓度为X轴，以这4组数据的平均吸光值为y轴，绘制曲线，得到较好的线性关系，如图2所示，此免疫比浊法可以检测β G的下限为6Pg/ml。
【权利要求】
1.一种特异性蛋白检测β -葡聚糖的比浊法，其方法是:利用基因重组的方法，克隆了来自鲎血中基因的大小为1251bp的特定氨基酸序列，将此序列连接到PET-15b的表达质粒上，转到BL21的表达菌中大量表达并纯化，该蛋白与葡聚糖具有特异结合性，建立一种检测葡聚糖的比浊法。
2.如权利要求1所述的一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，其方法是:表达蛋白与葡聚糖特异性结合，形成一定结构的复合物，在促聚剂聚乙二醇作用下，成为悬浮于反应溶剂中的微粒，使样品浊度发生变化；当一定波长光线通过浊度发生变化的反应混合物时，由于复合物的吸光度增大，故在一定范围内吸光度与复合物量呈正相关；当蛋白质浓度固定时，样品的浊度与其中所含葡聚糖量成正比，绘制标准曲线，从而达到未知β-葡聚糖的测定。
3.如权利要求2所述的一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，其方法是:采用粒径为180nm的大颗粒聚乙二醇微乳颗粒，增加β -葡聚糖和此特异蛋白反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间，在570nm的波长下进行检测；用固定的特异蛋白质浓度测定不同葡聚糖量，测出吸光值，绘制曲线，得到一定范围内的标准曲线，可以求出未知葡聚糖的量。
【文档编号】G01N33/68GK104502612SQ201510011372
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月9日 优先权日:2015年1月9日
【发明者】于源华, 田振华, 李忠和, 南航, 钟晓骝, 张爽, 刘桂莹, 刘凯 申请人:长春理工大学