一种用于检测牛布鲁菌病的ELISPOT检测试剂盒的制作方法与工艺

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种用于检测牛布鲁菌病的ELISPOT检测试剂盒及其在牛布鲁菌病诊断领域的应用。

背景技术：
牛布鲁菌病(以下简称“牛布病”)是由布鲁菌引起的人兽共患慢性传染病，家畜感染以后会出现不育以及流产等症状，公牛会出现关节炎以及睾丸炎，使配种能力明显下降，严重地威胁着牛群的健康状况，对畜牧业生产和人类健康造成非常大的危害。布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，感染机体后可引起细胞免疫应答。细胞免疫应答可以产生一系列的细胞因子，这些细胞因子在机体对抗感染的过程中发挥重要的作用。在机体感染布鲁菌时，特定的免疫原性蛋白可以激活T细胞反应，包括活化巨噬细胞和CD4+、CD8+毒性T细胞，产生几种重要的细胞因子，如γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。这些细胞因子在清除机体内布鲁菌的过程中起着重要的作用。特别是IFN-γ的分泌是宿主产生T细胞免疫反应的重要指标，其在对抗布鲁菌感染中发挥重要作用，通过检测抗原特异性的IFN-γ分泌状况可间接反映布鲁菌感染后产生的机体细胞免疫状况。IFN-γ主要是由特异性抗原刺激而活化的CD4+Th1细胞、CD8+T细胞及NK细胞等产生的细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤活性以及免疫调节功能，是机体防御系统的重要组成部分。IFN-γ的免疫学检测是在特异性抗IFN-γ单克隆抗体(McAb)的基础上建立的用于对样本中的IFN-γ进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出多种方法，如ELISA，酶联免疫斑点法(ELISPOT)，流式细胞术(FCM)分析法等。现阶段布病的检测手段主要包括以下几种：(1)细菌学方法，通过培养病原体，根据其生物学特征进行判断，诊断的可靠性和准确性较高；(2)分子生物学技术，如建立的布鲁菌属特异性的PCR检测方法、针对布鲁菌的插入序列IS711建立了AMOS-PCR方法等；(3)血清学诊断方法，包括试管凝集试验(SAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等；(4)布鲁菌素皮内变态反应，其抗原为布鲁菌素(以下简称Br-PPD)。但是，上述检测方法仍然不能满足本领域对牛布鲁菌感染的特异性检测的现实需要；且上述检测方法，不能满足本领域对牛布鲁菌感染早期检测的现实需要。虽然目前ELISA是公认的特异性和敏感性相对较高的布病诊断方法，但其基于体液免疫检测，特异性不理想。由于耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O517等革兰氏阴性细菌中的脂多糖(LPS)与布鲁菌的LPS具有极高的同源性，抗原结构几乎完全一致，血清学检测时经常出现交叉反应，从而使针对特异性抗体检测方法的特异性受到一定程度影响，其中也包括ELISA检测试剂盒的特异性。因此需要建立特异性更好的试剂盒用于牛布病的检测。

技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对牛布病的ELISPOT检测试剂盒，该试剂盒能够对牛布病进行高度特异性地检测。本发明的ELISPOT检测试剂盒还能够实现牛布病的早期检测。本发明涉及一种用于检测牛布鲁菌病ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照、特异性刺激剂，其中，所述捕获抗体为第一牛γ干扰素单克隆抗体，所述检测抗体为经过标记的第二牛γ干扰素单克隆抗体，特异性刺激剂为布鲁菌素Br-PPD，其中，所述支持介质与试剂接触面上有微孔滤膜；所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置；以及所述捕获抗体与所述检测抗体能与牛γ干扰素共同发生抗原抗体结合作用。本发明还涉及本发明的检测试剂盒在用于非诊断目的牛布鲁菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验布鲁菌抗原特异的牛IFN-γ。本发明的技术效果：本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。本发明基于Br-PPD的ELISPOT试剂盒，相比于其他的基于抗体的商品化ELISA试剂盒，能够实现牛布鲁菌感染的早期检测。并且，由于本发明基于Br-PPD的试剂盒为基于细胞水平的检测，相比于ELISA试剂盒，排除了交叉反应造成的假阳性的干扰，显示出良好的特异性。附图说明图1为实施例2中根据本发明的ELISPOT试剂盒的牛抗凝血样品检测结果：A.PWM刺激牛抗凝血检测结果；B.未刺激牛抗凝血检测结果；图2为实施例3中根据本发明的ELISPOT试剂盒的牛抗凝血样品检测结果图：A.PWM刺激牛抗凝血检测结果；B.Br-PPD刺激牛抗凝血检测结果；C.未刺激牛抗凝血检测结果。具体实施方式以下，对本发明的实施方式进行说明。本发明提供了一种用于检测牛布鲁菌病ELISPOT检测试剂盒，所述ELISPOT检测试剂盒包括：支持介质、捕获抗体、检测抗体、阴性对照和阳性对照、特异性刺激剂，其中，所述捕获抗体为第一牛γ干扰素单克隆抗体，所述检测抗体为经过标记的第二牛γ干扰素单克隆抗体，特异性刺激剂为布鲁菌素Br-PPD，其中，所述支持介质与试剂接触面上有微孔滤膜；所述捕获抗体包被在支持介质上或所述捕获抗体与支持介质分别放置；以及所述捕获抗体与所述检测抗体能与牛γ干扰素共同发生抗原抗体结合作用。术语“ELISPOT”为酶联免疫斑点实验(Enzyme-linkedImmunospot)的简称，具有高度敏感性，现已成为近年来应用最广泛的免疫检测方法之一，在疫苗研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。与传统的进行IFN-γ检测的抗病毒活性分析方法(AVA)相比，建立在免疫反应基础上的IFN-γ检测方法的灵敏度和特异性更高，作为细胞免疫状态的重要指标，针对IFN-γ的ELISPOT检测方法目前已被广泛地用于研究基础和临床免疫学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等。作为本发明的一种实施方式，所述第一牛γ干扰素单克隆抗体为牛γ干扰素单克隆抗体2G5，所述牛γ干扰素单克隆抗体2G5由保藏号为CCTCCNO：C2012107的杂交瘤细胞株2G5或其传代细胞株分泌产生；以及所述第二牛γ干扰素单克隆抗体为牛γ干扰素单克隆抗体5E11，所述牛γ干扰素单克隆抗体5E11由保藏号为CCTCCNO：C2012108的杂交瘤细胞株5E11或其传代细胞株分泌产生。杂交瘤细胞株2G5和杂交瘤细胞株5E11公开于专利CN102965343B。作为本发明的一种实施方式，所述支持介质为微孔滤膜板。更优选地，所述支持介质为披覆PVDF薄膜微孔培养板。其中，优选地，所述支持介质与试剂接触面上有PVDF膜。作为本发明的一种实施方式，所述捕获抗体包被在微孔滤膜板中。所述ELISPOT检测试剂盒中，微孔滤膜板可以事先包被有捕获抗体，也可以只提供空白微孔滤膜板与捕获抗体，在检测前由操作者自行采用常规方法在微孔滤膜板上包被捕获抗体。所述微孔滤膜板可为各种常见规格的微孔滤膜板，如96孔滤膜板。在本发明提供的牛布病ELISPOT检测试剂盒中，所述第二牛γ干扰素单克隆抗体不同于所述第一牛γ干扰素单克隆抗体。优选地，所述标记包括生物素标记或碱性磷酸酶标记。更优选地，所述标记为生物素标记。所述标记牛IFN-γ单克隆抗体的方法采用常规。作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：1)亲和素-碱性磷酸酶结合物；2)底物液；3)浓缩PBS缓冲液、封闭液、细胞培养液、洗涤液。上述试剂均为ELISOPT检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入检测方法中，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是方法中同时包括亲和素-碱性磷酸酶结合物、底物液和洗涤液。所述底物液可为ELISPOT检测方法中常用的通用底物液，如液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)底物液。所述洗涤液可为ELISPOT检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。进一步的，所述方法中还可以有选择地包括其他ELISPOT检测所需通用试剂，如封闭液、细胞培养液(完全1640培养液)等。所述封闭液可为包被微孔滤膜板常用的封闭液，如脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。通常情况下，本发明的ELISPOT检测试剂盒中，各试剂分别隔离储存。利用本发明的ELISPOT检测试剂盒检测牛抗凝血样品的检测方法包括下列步骤：1、捕获抗体包被微孔滤膜板；2、抗凝血孵育及检测①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；②在上述捕获抗体包被的微孔滤膜板中加入下列试剂：每个抗凝血样品包括3个试验孔，50μL细胞培养液至阴性对照孔，50μL细胞培养液稀释的PWM至阳性对照孔(终浓度为5μg/mL)，50μL细胞培养液稀释的特异性刺激剂Br-PPD至试验孔(终浓度为10μg/mL)。上述每孔加入50μL牛抗凝血，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；③弃培养上清，洗板后，加入1μg/mL的生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；④洗板，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；⑤每孔加入100μL底物液，放置于室温避光显色。在微孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将微孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。本发明还涉及本发明所述的检测试剂盒在用于非诊断目的的牛布鲁菌感染检测中的应用，其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验布鲁菌抗原特异的牛IFN-γ。作为本发明的一种实施方式，所述应用为用于非诊断目的的牛布鲁菌感染或布鲁菌抗原特异的牛IFN-γ的早期检测中的应用。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1本发明的基于Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒的制备ELISPOT试剂盒组装步骤如下：1)牛γ干扰素单克隆抗体2G5的纯化分泌牛γ干扰素单克隆抗体2G5的杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，待产生腹水后，收集腹水，将收集的2G5腹水使用ProteinG亲和层析方法进行纯化。2)生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体(记为Bio-5E11)的制备分泌牛γ干扰素单克隆抗体5E11的杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，待产生腹水后，收集腹水，将收集的5E11腹水使用ProteinG亲和层析方法进行纯化。将纯化的5E11单抗采用标准生物素标记法进行标记：溶解2～10mg单抗5E11蛋白于1mL的磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数；平衡生物素至室温，加2mgSulfo-NHS-Biotin于100μL超纯水中，加入一定浓度的生物素；室温30分钟，或冰上放置2小时；用30mLPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5mL或1mL于单独的管中，以280nm的吸收值测定单抗蛋白含量。本发明的5E11单抗也可以使用本领域公知的其他方法进行标记。3)将96孔滤膜板、单抗2G5、生物素标记牛γ干扰素单克隆抗体Bio-5E11、特异性刺激剂布鲁菌素Br-PPD、阴性对照(完全1640培养基)和阳性对照(美洲商陆PWM)分别包装组装成试剂盒。进一步的，试剂盒中依据需要组装入：亲和素-碱性磷酸酶结合物、NBT/BCIP底物液、浓缩PBS缓冲液、封闭液、细胞培养液、磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液中的一种或多种。试剂盒中，微孔滤膜板、单抗2G5也可采用预先包被了牛γ干扰素单克隆抗体2G5的微孔滤膜板替代。包被牛γ干扰素单克隆抗体2G5的微孔滤膜板的制备方法：①96孔滤膜板中加入2.5μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体2G5，100μL/孔，4℃过夜包被；②弃包被液，使用含有0.05％吐温的灭菌PBST洗板3次，5min/次；③加入含10％胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，37℃孵育封闭2h；④弃封闭液，使用PBST洗板1次，将96孔滤膜板放于密封袋中，置4℃保存。上述制备的牛γ干扰素单克隆抗体2G5的微孔滤膜板需在1周内使用。实施例2基于非特异性刺激剂PWM的ELISPOT检测试剂盒检测牛外周血样品1.实验材料使用实施例1中制备的牛布病ELISPOT检测试剂盒。2.抗凝血孵育及检测①无菌采取1mL牛血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；②在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：每个抗凝血样品包括2个试验孔，50μL细胞培养液至阴性对照孔，50μL细胞培养液稀释的PWM至阳性对照孔(终浓度为5μg/mL)，上述每孔加入50μL牛抗凝血，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；③将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；⑤每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。结果如图1所示。结果显示在检测牛抗凝血样品时，阳性对照孔(A)中出现的有效斑点数显著多于阴性对照孔(B)，结果表明本发明的试剂盒可用于对牛外周抗凝血进行直接检测，结果同样可以有效检测出PWM刺激牛抗凝血中分泌牛IFN-γ的T淋巴细胞，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。实施例3使用本发明的基于特异性刺激剂Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒检测牛外周血样品1.实验材料使用实施例1中制备的牛布病ELISPOT检测试剂盒。2.抗凝血孵育及检测①无菌采集1mL布病阳性牛的血液加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；②在上述包被的96孔滤膜板中加入下列试剂：每个抗凝血样品包括3个试验孔，50μL细胞培养液至阴性对照孔，50μL细胞培养液稀释的PWM至阳性对照孔(终浓度为5μg/mL)，50μL细胞培养液稀释的特异性刺激剂Br-PPD至试验孔(终浓度为10μg/mL)。上述每孔加入50μL牛抗凝血，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO2培养箱培养24-48小时；③将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBST洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入1μg/mL的牛γ干扰素检测抗体Bio-5E11，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；④用PBS洗板3次，5min/次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-碱性磷酸酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1小时；⑤每孔加入100μL底物液氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置于室温避光显色。在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下过夜或37℃烤箱中2-3小时烘干；⑥使用倒置显微镜计数每个反应孔中紫色的斑点，每一个点代表一个分泌牛γ干扰素的T细胞；或将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。结果如图2所示。结果表明本发明的试剂盒也可用于对牛抗凝血进行直接检测，结果同样可以检测出阳性孔中分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞。3.试验有效的条件PWM阳性对照孔中斑点数大于阴性对照孔中斑点数，且PWM阳性对照孔中斑点数>20，判定抗凝血样品有效。4.牛布病结果判定①如果阴性对照孔中斑点数<5，Br-PPD检测孔中斑点数减去阴性对照孔中斑点数>6时；②如果阴性对照孔中斑点数>6，Br-PPD检测孔中斑点数>2倍阴性对照孔中斑点数时；出现以上任一检测结果，判定为牛布病阳性，反之则判为阴性。结果显示本发明的试剂盒可以有效检测出牛布病抗原特异性分泌牛γ干扰素的T淋巴细胞。实施例4基于Br-PPD的牛布病外周血γ干扰素ELISPOT检测试剂盒与布鲁菌cELISA抗体检测试剂盒结果比较地点：江苏某牛场。时间：2014年2月。试验头数：150头。本试验检测了一定数量的临床奶牛抗凝血样品，并且与布鲁菌cELISA抗体检测试剂盒(SVANOVIR)进行对比，以进一步确认Br-PPD作为牛布病外周血γ-干扰素体外释放试验刺激原的效果。IFN-γ试验方法和结果判定同实施例3所述，结果如表1所示。表1.Br-PPD用于牛IFN-γ体外释放试验结果与布鲁菌cELISA抗体检测试剂盒结果对比(单位：头)“+”代表阳性，“-”代表阴性。经统计学分析，基于Br-PPD进行的牛IFN-γ体外释放试验与布鲁菌cELISA抗体检测试剂盒结果的阳性符合率为70.8％(17/24)，阴性符合率为88.9％(112/126)，总符合率为86.0％(129/150)，具有良好的检测效果，显示其在牛布病诊断中具有较好的诊断价值。实施例5：基于Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒用于布鲁菌感染的早期检测地点：江苏某牛场。时间：2015年4月。试验头数：12头。所有实验奶牛均为性成熟且未孕奶牛，无布鲁菌疫苗免疫史，无相关疾病感染。共计12头，6头免疫实验组(每头奶牛注射4.4×109CFU的S19疫苗)和6头实验对照组(仅注射生理盐水)。自免疫起48h内对牛严格观察奶牛是否有过激反应。血清样品用布鲁菌间接酶联免疫吸附(iELISA)试验抗体检测试剂盒(SVANOVIR)检测。抗凝血样品同步使用牛布病ELISPOT检测试剂盒进行检测。S19疫苗免疫后，在第0、3、7、15、30等天分别对免疫组奶牛和对照组奶牛采集血清样品进行抗体水平的检测，免疫组部分奶牛的抗体分泌水平在一周后开始逐步上升，15天左右奶牛抗体维持在一个较高水平，且会持续较长时间。而对照组奶牛的抗体分泌水平则一直保持较低水平。S19株免疫后，分别在第0、3、7、15、30等天采全血样品，并同步进行基于Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒检测。在S19疫苗免疫后第3天，Br-PPD刺激全血后的T淋巴细胞斑点数无论是与第一次试验(第0天)检测结果相比，还是与对照组的试验结果相比，均有显著提高。实验结果显示，在布鲁菌感染过程中，γ干扰素的产生比抗体更早，牛布病ELISPOT检测试剂盒可弥补基于抗体的检测方法，如ELISA检测试剂盒的缺陷，用于布鲁菌感染的早期检测。实施例6：基于Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒检测无布病牛群地点：江苏某牛场。时间：2015年6月。试验头数：100头。所有实验奶牛均为新西兰进口荷斯坦牛，为布病净化牛群。血清样品用布鲁菌iELISA抗体检测试剂盒(SVANOVIR)、布鲁菌cELISA抗体检测试剂盒(SVANOVIR)、虎红平板凝集试验(RBPT)抗原(青岛立见诊断技术发展中心)进行检测。抗凝血样品同步使用基于Br-PPD的牛布病ELISPOT检测试剂盒进行检测。结果如表2所示。表2.不同检测方法在布病净化牛群中检测效果比较检测方法检测样品数(头)阳性数(头)阳性率iELISA10022％cELISA10011％RBPT10033％ELISPOT10000％结果显示，在布病净化牛群中，牛布病外周血γ干扰素ELISPOT检测试剂盒的特异性为100％，而其它三种基于抗体的检测方法都存在一定比例的假阳性。由于耶尔森氏菌09和大肠杆菌O517等革兰氏阴性细菌中的脂多糖(LPS)与布鲁菌的LPS具有极高的同源性，抗原结构几乎一致，血清学检测时经常出现交叉反应，从而使基于抗体的检测方法的特异性受到一定程度影响。而基于Br-PPD的牛布病外周血γ干扰素ELISPOT检测试剂盒排除了该方面的干扰，显示其具有良好的特异性。以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。