专利名称：生物纳米磁性靶向抗癌药物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物纳米磁性靶向抗癌药物，是以生物纳米磁小体为载体的一种磁靶向药物。
背景技术：
目前，癌症是人类死亡率居首位的顽症，至今，癌症治疗仍大多采用传统的全身化疗法，由于化学药物在患者全身分布，对患者正常组织细胞产生毒害，临床使用中存在许多副作用，例如脱发，脊髓毒性，肝、肾功能衰竭等，造成不良反应，致使癌症患者痛苦不堪，很多患者最终并非死于癌症本身，而是死于化疗引起的副作用。
为了提高肿瘤化疗效果，减轻药物对正常组织的毒副作用，近几十年来，以局部靶向定位治疗为目的的各种新型药物投递系统成为研究热点。其中磁靶向治疗在癌症局部靶向定位治疗中展现出巨大的应用前景，有望逐步代替全身化疗，成为一种高效、安全的癌症治疗方法。磁靶向治疗是以纳米磁性粒子为药物载体，利用磁粒特殊的超顺磁性能，在外磁场推动下，使药物具有准确的主动靶向性，药物对细胞膜和血脑屏障强大的穿透力，直接作用于肿瘤细胞，从而提高药物的疗效，并有效地降低对对正常细胞的毒副作用。
目前，磁靶向治疗的研究主要集中于人工合成铁氧体磁性纳米载药体系和磁性液体材料的制备以及其相关技术对恶性肿瘤的早期诊断和治疗。研究表明，人工合成的磁性纳米颗粒能与多种抗癌药物连接，具有较强的靶向定位功能，并成功应用于一些癌症的早期诊断和治疗。然而，目前由于技术原因，人工合成的磁颗粒粒形差异大，大小不均匀，粒度分布范围宽，达到纳米级颗粒的比例只占小部分；此外，还由于无机非金属纳米颗粒表面电荷密度偏低，易聚集，难降解的原因，导致药物装载量低，不稳定，毒性较大，使应用范围受到局限。
生物纳米磁小体又称细菌纳米磁小体(magnetosome)，是最近十几年才发现的一种新型的纳米生物磁体，它是在具有趋磁性的革兰氏阴性细菌一趋磁细菌(magnetotactic bacteria)细胞内形成的纳米磁性颗粒，磁粒大小在35-120nm范围内，在永久的单磁畴晶尺寸范围之内，主要成分为Fe3O4或Fe3S4，每个磁颗粒表面由嵌合蛋白质的磷脂双分子脂膜包被，分离纯化后的细菌纳米磁小体在溶液中分散性好，稳定性高。目前，经固定化酶载体，免疫检测、基因转移，DNA、RNA的分离和标记等方面的研究结果表明，细菌纳米磁小体固定化酶量大(可达人工合成磁性纳米颗粒的100倍)，抗体连接量大，免疫检测灵敏度高，DNA吸附量大，应用前景非常广阔。但是由于趋磁细菌对营养的要求苛刻，以及具有微好氧、厌氧等特性，其培养水平一直很低，难以获得足够量高纯度磁小体提供相关实验使用，迄今为止，尚未见采用生物纳米磁小体进行载药方面研究的报道。最近，中国农业大学已建立了大量培养趋磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1的方法，已摸索出简便的磁小体回收及纯化的技术路线，通过破碎趋磁细菌细胞，提取并纯化趋磁细菌细胞内合成的纳米磁颗粒，并获得了国家专利(专利号02125920.8，03153488.0)。
发明内容
本发明的目的是针对靶向治疗肿瘤的需求，解决目前人工合成纳米磁性药物载体普遍存在的载药量低、稳定性差、毒性高和靶向性不强等问题，利用生物纳米磁小体这一纳米级、晶型稳定的自然资源为药物载体，制备出一种具有适当的粒径与粒形，高载药量和药物包封率，生物相溶性好，易降解，毒性低，稳定性高的具有抗癌功能的纳米磁性靶向药物及生物纳米磁小体载药方法。
本发明生物纳米磁性靶向抗癌药物由生物纳米磁小体与抗癌药物通过物理吸附或化学偶联剂偶联而成，所说的生物纳米磁小体是趋磁细菌细胞内形成的纳米磁性颗粒，粒径35-120nm，主要成分为Fe3O4或Fe3S4，单个磁颗粒有脂膜包被，所说的抗癌化学药物包含化疗药物、抗体药物、核酸类药物、放射性核素。常用的化疗药物如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依达比星、吡柔比星、丝裂霉素、平阳霉素、培洛霉素、伊力替康、紫杉醇等；常用的核酸类药物如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羟基脲、6-羟基嘌呤等；常用的放射性核素如99mTc、131I、123I、111In等)；常用的抗体药物如Herceptin(赫塞汀)、Rituxan(利妥昔单抗)、美妥昔单抗、Zevalin、Bexxar、Edrecolomab、muromonab、Trastuzumab、Alemtuzumab等，包括抗IgG1、抗CEA、抗CD3、抗CD33、抗CD52、抗CD20、抗ERBB2、抗IGE Fc、抗EpCAM等多种类型。
本发明生物纳米磁性靶向抗癌药物可分别由以下方法制备一.物理吸附法步骤如下将抗癌化学药物、生物纳米磁小体的纯水或缓冲溶液混合，搅拌或间断地脉冲超声下反应；用磁铁吸出磁小体，用纯水或磷酸缓冲溶液洗涤数次，再用磁铁吸出磁小体，得产品。
本法通过物理吸附的方法将抗癌药物吸附在磁小体的表面，适用于几乎所有的抗癌化学药物。
二.化学偶联法生物纳米磁小体外包被的脂膜由嵌合蛋白质的磷脂双分子层组成，其生化性质和功能与细胞膜一致。目前已有三种趋磁细菌菌株合成的磁小体脂膜组分被证实Magnetospirillum.Magnetotacticum MS-1的磁小体的包膜脂类包括三个部分中性脂类及游离脂肪酸、糖脂及硫脂、磷酸脂，它们在总脂中所占重量百分比分别为8％、30％、62％，其中磷酸脂的主要成分是磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺；M.magneticum AMB-1的磁小体包膜的磷脂双分子层含有98％的脂类和2％其他组分的复合物，每毫克磁小体含有31.79微克的脂肪酸，其中棕榈油酸与油酸占90％，磷脂占总脂类的58％，磷脂酰乙醇胺则占磷脂的50％。对M.gryphiswaldense MSR-1的磁小体包膜的生化分析表明，其含有的磷脂和脂肪酸与亚细胞器外膜上的类似，都大量存在磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。
本发明充分利用生物纳米磁小体表面脂膜的上述组分以及其中丰富的氨基、邻二醇、羧基等活性基团，采用不同的连接方法和特定的偶联剂，针对不同的化学基团与各种抗癌药物进行连接，制备生物纳米磁性靶向抗癌药物。
本发明采用的化学偶联方法有以下几种1、直接偶联法实现氨基与氨基的连接由于磁小体外包被的脂膜中含有重要组分为磷脂酰乙醇胺，带有大量的伯氨基，另一方面，常见的抗癌药物几乎均含氨基，如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依达比星、吡柔比星等化疗药物及阿糖胞苷、甲氨蝶呤、羟基脲、6-羟基嘌呤等)等核酸药物，化学式中均含有一个氨基；而丝裂霉素、平阳霉素、培洛霉素等化疗药物以及Herceptin(赫塞汀)、Rituxan(利妥昔单抗)、美妥昔单抗、Zevalin、Bexxar、Edrecolomab、muromonab、Trastuzumab、Alemtuzumab等抗体药物、蛋白或抗体标记的放射性核素等药物则含有多个氨基。本发明根据这一特点，选用特定的偶联剂与氨基连接，实现纳米生物磁小体脂膜与化学药物的偶联。
偶联方法如下原料抗癌药物及生物纳米磁小体脂膜分别含有氨基，采用偶联剂，所说的偶联剂是含有如下至少两个相同或不相同基团的化合物醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基；其中含N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基的偶联剂也可由含羧基的试剂与N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基丁二酰亚胺磺酸钠或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺(EDC)反应而得。可将偶联剂与生物纳米磁小体和抗癌药物二者同时反应，一步偶联，也可将偶联剂先与生物纳米磁小体反应，然后再与抗癌药物反应，二步偶联。
偶联剂优选自戊二醛、乙二醛、丙二醛、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(N，N’-Disuccinimidyl suberate，DSS)、N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(N，N’-Disuccinimidyl carbonate，DSC)、3-琥珀酰亚胺-氨基三醋酸酯、丁二酸/酐或戊二酸/酐。
以偶联剂戊二醛为例，偶联反应通式如下式中黑式圆球表示包有脂膜的生纳米磁小体，矩形框表示抗癌药物，下同。
以上偶联剂也可先与生物纳米磁小体及聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖类聚合物一步或分步反应，使生物纳米磁小体先与聚合物连接，再将连接了聚合物的生物纳米磁小体与N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺9(简称EDC)反应，使聚合物上的羧基转化为N-琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与原料抗癌药物反应，得产品。
以聚谷氨酸(简称PLGA，下同)为例，偶合过程如下式
聚合物PLGA分子含有氨基和多个羧基，上式中，由偶联剂戊二醛使生物纳米磁小体和聚合物PLGA偶联，使其连接上多个羧基官能团，然后在EDC的作用下使各羧基转化为琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与抗癌药物的氨基连接，从而实现纳米磁小体与抗癌药物的偶联。本法利用聚合物含有多个羧基的特性，可使磁小体偶联更多的抗癌药物。
2.氧化法实现邻二醇结构与氨基的连接对于脂膜含有邻二醇基团的生物纳米磁小体，本发明用氧化剂高碘酸钠或高碘酸钾与生物纳米磁小体反应，将磁小体表面脂膜分子中的邻二醇结构氧化为醛基，然后与含氨基的抗癌药物反应，得产品。
反应通式如下 3.间接法实现羧基与氨基的连接对于原料抗癌药物和生物纳米磁小体中的一方含有羧基，另一方含有氨基的情况，本发明先以N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺(简称EDC)与含羧基的一方反应，将羧基转化为琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与含氨基的一方反应，得产品。
反应路线如下
4.用异型偶联剂实现氨基与巯基或二硫键的连接鉴于生物磁小体外包被的脂膜含有大量的伯氨基，另一方面，几乎所有含抗体以及蛋白类药物(如抗体药物、蛋白或抗体标记的放射性核素、部分化疗药物等)都带有二硫键或巯基的特点，本发明选用异型偶联剂对生物纳米磁小体的氨基修饰，使其连上二硫键或马来酰亚胺基，然后与含有巯基的药物连接；或再将磁小体已连上的二硫键还原成巯基，再与含有二硫键的抗癌药物连接；本方法通过不同途径使抗癌药物和生物纳米磁小体中的一方连有二硫键，另一方连有巯基，利用二硫键与巯基的交换反应实现磁小体与抗癌药物的偶联；或者一方连有马来酰亚胺基，另一方连有巯基，以巯基取代反应实现磁小体与抗癌药物的偶联。
所采用的异型偶联剂是指一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基，另一端含有二硫键或N-琥珀酰亚胺基的化合物。其中一端含N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基的偶联剂也可由含羧基的试剂与N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基丁二酰亚胺磺酸钠或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺(EDC)反应而得。
常用的异型偶联剂有3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)、N-(4-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺(GMBS)、N-(4-马来酰亚胺基癸酰氧基)琥珀酰亚胺(HMCS)、N-(4-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺(GMBS)、N-(4-马来酰亚胺基十一酰氧基)琥珀酰亚胺(KMUS)、N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-EMCS)、N-(4-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-GMBS)、N-(4-马来酰亚胺基癸酰氧基)琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-HMCS)、N-(4-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-GMBS)、N-(4-马来酰亚胺基十一酰氧基)琥珀酰亚胺磺酸钠(Sulfo-KMUS)等。
对于抗癌药物含有巯基或二硫键，生物纳米磁小体含有氨基的情况，采用本法如下将异型偶联剂与生物纳米磁小体反应，使磁小体连接二硫键或N-琥珀酰亚胺基，然后由以下三个工艺路线之一得产品(1)将连接了二硫键或N-琥珀酰亚胺基的磁小体直接与含巯基的抗癌药物反应；(2)将含二硫键的抗癌药物与二硫苏糖醇(简称DTT)反应使二硫键转化为巯基，再与连接了二硫键或N-琥珀酰亚胺基的磁小体反应；(3)连接了二硫键的磁小体与DTT反应使二硫键转化为巯基，然后与含二硫键的抗癌药物反应。
工艺路线(1)和(2)包含于下式(式中表示含巯基的药物可由含二硫键药物与二硫苏糖醇反应而得)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)为异型偶联剂 或者以N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)为异型偶联剂 工艺路线(3)如下式表示
对于抗癌药物和生物纳米磁小体均含有氨基的情况，采用本法如下将生物纳米磁小体及抗癌药物分别与异型偶联剂反应，使磁小体及抗癌药物分别连接二硫键或一方连接二硫键另一方连接N-琥珀酰亚胺基，再将其中连接二硫键的一方与二硫苏糖醇反应而还原成巯基，然后与未还原的另一方反应，得产品。
当抗癌药物和磁小体分别与同一异型偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)反应时，本法如反应路线(a)。
当抗癌药物和磁小体分别与不同异型偶联剂N-(6-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)和磁小体与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)反应时，本法如反应路线(b)。
路线(a) 路线(b) 本方法还可在以上异型偶联剂与抗癌药物或纳米磁小体的一方反应之前，先与聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖类聚合物反应，使偶联剂与聚合物连接，再与N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺反应，使聚合物上的羧基转化为N-琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与该方原料反应。
以聚谷氨酸(简称PLGA)为聚合物，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)为偶联剂，反应路线如下
本发明以上各种偶联方法中，各步反应均在纯水或磷酸缓冲溶液中搅拌或间断地脉冲超声下进行，生物纳米磁小体的每次反应后产物均用磁铁吸出并纯水或缓冲溶液洗涤。
本发明为磁小体与具有不同物理化学性质的药物之间的偶联方法提供了多种的选择，各种偶联方法均在常温(0-45℃)常压下进行，工艺简单易行。
综上所述，本发明利用生物纳米磁小体外层脂膜独特的结构特征和活性官能团，采用各种物理和化学方法将生物纳米磁小体与抗癌药物偶联，制得生物纳米磁性靶向抗癌药物。载有抗癌药物的生物纳米磁小体在患者体内通过降解磁小体即可实现药物的释放。通过外加磁场，生物纳米磁性靶向抗癌药物可以被准确地运送到病灶部位，减少药物与正常组织的接触，降低副作用，提高药效，实现针对肿瘤的局部靶向定位治疗。由于生物纳米磁小体来自活体细胞，具有优越的生物相溶性，毒副作用小；生物纳米磁小体粒型一致，颗粒均匀，晶型稳定，无其它杂质；其尺寸均在纳米级，具有较大的比表面积；电负性较大且可调节，不易聚集；同时由于每个磁小体的单体均有脂膜包被，活性基团丰富，表面可进行各种化学修饰，方便地与多种药物连接。因此，本生物磁性靶向抗癌药物在靶向定位治疗肿瘤方面展现出诱人的应用前景。
具体实施例方式
下面各实施例中采用的试剂和仪器说明如下生物纳米磁小体由MSR-1趋磁细菌菌株培养而得，粒径为40-50nm，由中国农业大学生物学院微生物系提供。
抗癌化疗药物阿霉素(ADM)购于北京云迪同创医药科技有限公司。
水二次去离子水。
氯仿、乙醇、二氧六环、盐酸、氢氧化钠等所用溶剂和试剂均为分析纯。
检测设备日本岛津UV-3100型紫外-可见光谱仪，石英池厚1cm和0.5mm；KQ-100型超声波振荡器；实施例1物理吸附法制生物磁小体载阿霉素实验步骤将抗癌药物阿霉素溶液和生物纳米磁小体悬浮液混合，搅拌或间断地脉冲超声下反应0.5-24小时，4℃放置过夜；用磁铁吸附磁小体，用纯水或缓冲溶液洗涤数次，再用磁铁吸附磁小体，得产品。
实验结果由表一结果可以看出(1)采用直接物理吸附法，生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量高，本实验最高可达11.07×103μgADM/mgBMP，而通常人工合成铁氧体磁性纳米颗粒中阿霉素的含量57.5μg，可见生物纳米磁小体载药量比其高近192倍。
(2)采用直接物理吸附法，载药量大小与两者的浓度及浓度比例密切相关，随CAMS/CBMP的值的增大，BMP的单位载药量也显著增加。
(3)BMP绝对浓度也强烈影响其载药量。在BMP浓度较低的条件下(0.018mg/ml)，在CAMS/CBMP值为1∶1时其单位载药量为431.1μgADM/mgBMP，是人工合成铁氧体磁性纳米颗粒的7.5倍。但当BMP浓度升高至0.2mg/ml时，即使在CAMS/CBMP值为1.6∶1时其单位载药量仅为101.6μgADM/mgBMP，约为人工合成铁氧体磁性纳米颗粒的1.8倍。
表一、不同浓度比条件下生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量数据
其中CADM、CBMP各表示阿霉素、生物纳米磁小体投料后在混合体系中的浓度，CADM/CBMP为阿霉素与生物纳米磁小体的浓度比，以下各表同。
实施例2直接偶联分步法制生物磁小体载阿霉素实验步骤向磁小体悬浮液中加入偶联剂，混匀，搅拌或间断地脉冲超声反应0.5-24小时，反应产物用磁铁吸出，洗涤数次，去除未反应的偶联剂，然后再用磁铁吸附。将阿霉素溶液与上述经偶联剂修饰后的磁小体混合，搅拌或反复间断地脉冲超声，反应0.5-24小时，反应产物用磁铁吸附，去除未反应的抗癌化学药物，纯水或磷酸缓冲溶液洗涤数次后，再用磁铁吸出磁小体，得产品。
实验结果从表二结果可以看出(1)采用直接偶联分步法，生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量较高，本实验中用戊二醛做偶联剂可达536.4μgADM/mgBMP，通常人工合成铁氧体磁性纳米颗粒中阿霉素的含量高近10倍。
直接偶联分步法载药量大小与两者的浓度及浓度比例有关，随CAMS/CBMP的值的增大，BMP的单位载药量相应增加。但与直接吸附法相比，直接偶联分步法载药量相对较稳定，变化没有直接物理吸附法的显著。
(2)与直接吸附法不同，直接偶联分步法的载药量与BMP的绝对浓度关系没有直接关系。BMP浓度升高40倍时其单位载药量单位载药量变化不明显。
(3)不同偶联剂对载药量影响很大。采用戊二醛和丁二酸作为偶联剂时BMP的载药量大于采用DSC作为偶联剂时的载药量。
表二、采用直接偶联分步法不同条件下生物纳米磁小体(BMP)阿霉素(ADM)载药量数据
实施例3直接偶联一步法制生物磁小体载阿霉素实验步骤将生物纳米磁小体悬浮液与偶联剂水溶液和抗癌化学药物的溶液混合，搅拌或间断地脉冲超声下反应0.5-24小时，用磁铁吸附反应产物，去除未反应的反应物。纯水或磷酸缓冲溶液洗涤数次后，再用磁铁吸出磁小体，得产品。
实验结果
表三、采用直接偶联一步法不同条件下生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(ADM)载药量数据
以上结果表明(1)用直接偶联一步法，生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量高，本实验中可达1201μgADM/mgBMP，比通常人工合成铁氧体磁性纳米颗粒载阿霉素的量高出20倍以上。
(2)采用直接偶联一步法BMP载阿霉素药量稳定，戊二醛浓度变化对载药量有一定影响。适当增加戊二醛浓度可以提高载药量。
(3)直接偶联一步法中，不同偶联剂对载药量影响很大。本实验中采用戊二醛作为偶联剂时BMP的载药量大于采用丁二酸和DSC作为偶联剂时的载药量。
实施例4高碘酸钠氧化法制生物纳米磁小体载阿霉素实验步骤生物纳米磁小体粒的悬浮液中，加入氧化剂高碘酸钠，搅拌或间断地脉冲超声下反应0.5-24小时；用磁铁吸出磁小体，用纯水或缓冲溶液洗涤数次，去除未反应的氧化剂。将氧化后的磁小体与抗癌化学药物溶液混合，搅拌或间断地脉冲超声下反应0.5-24小时，反应物用磁铁吸附去除未反应的抗癌化学药物；用纯水或磷酸缓冲溶液洗涤数次后，再用磁铁吸出磁小体，得产品。
实验结果表四、采用高碘酸钠氧化法不同条件下生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(ADM)载药量数据
以上结果表明采用高碘酸钠法，生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量本实验中可达465.6μgADM/mgBMP，比通常人工合成铁氧体磁性纳米颗粒载阿霉素的量高8倍。同时，NaIO4浓度对载药量有影响，在NaIO4浓度为0.0175左右，BMP对ADM的载药量最大。
实施例5异型双功能偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(下称SPDP)法制生物纳米磁小体载阿霉素实验步骤生物纳米磁小体用磷酸缓冲溶液悬浮，迅速溶入异型双功能偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的，搅拌或脉冲超声下反应0.5-24小时，用磁铁吸出磁小体，去除未反应的偶联剂和副产物。用磷酸缓冲溶液洗涤数次后，向SPDP处理后的磁小体悬浮液中加入固体二硫苏糖醇，搅拌，脉冲超声下反应0.5-24小时，用磁铁吸出磁小体，用缓冲溶液洗涤数次；抗癌化学药物与3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯反应后再加入固体二硫苏糖醇反应；将上述的处理的磁小体和抗癌化学药物的纯水或缓冲溶液混合，搅拌或反复脉冲超声反应0.5-24小时，用磁铁吸出磁小体，用纯水或缓冲溶液进行洗涤，用磁铁吸出磁小体，得产品。
实验结果
表五、采用SPDP不同条件下生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(ADM)载药量数据
由表五的结果可知，采用SPDP法，生物纳米磁小体(BMP)对阿霉素(AMS)载药量稳定，本实验中达297.4μgADM/mgBMP，比通常人工合成铁氧体磁性纳米颗粒载阿霉素的量高出5倍以上。
实施例6生物纳米磁小体载药稳定性实验实验步骤分别将实施例1-5制得的生物纳米磁小体载阿霉素药物粒子，加入0.8％生理盐水溶液，混匀后超声10min，用磁铁将磁小体吸附在容器底部，取上清液用光谱仪测紫外光谱。
实验结果表六.不同载药方法对生物纳米磁小体载阿霉素稳定性的影响数据
表六中的上清液中游离阿霉素百分含量反映出磁小体的载药稳定性，此值越低，则稳定性越高。载药稳定性与偶联剂的种类以及偶联方法有关。实验结果表明，采用戊二醛作为偶联剂的直接偶联一步法稳定性最高，与磁小体呈不稳定结合状态的阿霉素比例仅0.26％。
药物和纳米磁小体结合的稳定性关系到靶向抗癌药物的毒副性与释药速率，与磁小体呈不稳定结合状态的阿霉素比例越小，进入全身循环的游离药物也相应减少，靶向性效率更高。
实施例7生物纳米磁小体对大鼠的安全性检测用趋磁细菌内提取的高纯度磁小体，通过舌下静脉注射SD大鼠进行毒理实验，结果为大鼠半数致死量为62.7mg/kg。从存活大鼠腹腔静脉取血进行血液生化检测，其血常规(24项)、心激酶与肝肾功能均未见异常。
对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肠和肾上腺进行普通病理切片检查，同时取样作电镜超薄切片，观察磁小体在脏器中的分布情况。在所给予剂量范围内磁小体并未引起组织堵塞和梗死现象；仅在肝脏的肝细胞而非巨噬细胞内聚集，其它脏器中未发现有磁小体。
需要说明的是以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.生物纳米磁性靶向抗癌药物，其特征是由生物纳米磁小体与抗癌药物通过物理吸附或化学偶联剂偶联而成，所说的生物纳米磁小体是趋磁细菌细胞内形成的纳米磁性颗粒，粒径35-120nm，主要成分为Fe3O4或Fe3S4，单个磁颗粒有脂膜包被，所说的抗癌药物包含化疗药物、核酸类药物、放射性核素或抗体药物。
2.一种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，其特征是将抗癌化学药物和生物纳米磁小体在纯水或磷酸缓冲溶液中混合，搅拌或脉冲超声下进行物理吸附；用磁铁吸出磁小体，洗涤，得产品。
3.一种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，其特征是原料抗癌药物及生物纳米磁小体分别含有氨基，采用偶联剂与生物纳米磁小体及抗癌药物反应，使磁小体及抗癌药物所含的氨基与偶联剂连接；磁小体、抗癌药物及偶联剂三者同时反应，一步偶联得产品，或将该偶联剂先与生物纳米磁小体反应，然后再与抗癌药物反应，分步偶联得产品；所说的偶联剂是含有如下至少两个相同或不相同基团的化合物醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基。
4.根据权利要求3所述的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，其特征是所说的偶联剂先与生物纳米磁小体及聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖类聚合物一步或分步反应，使生物纳米磁小体先与聚合物连接，再将连接了聚合物的生物纳米磁小体与N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺反应，使聚合物上的羧基转化为N-琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与原料抗癌药物反应，得产品。
5.一种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，原料抗癌药物含有氨基，生物纳米磁小体含有邻二醇基团，其特征是用氧化剂高碘酸钠或高碘酸钾与生物纳米磁小体反应，将生物纳米磁小体表面脂膜分子中的邻二醇结构氧化为醛基，然后与抗癌药物反应，得产品。
6.一种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，原料抗癌药物和生物纳米磁小体中的一方含有羧基，另一方含有氨基，其特征是以N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺与含羧基的一方反应，使羧基转化为N-琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与含氨基的一方反应，得产品。
7.一种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，原料抗癌药物含有巯基或二硫键，生物纳米磁小体脂膜含有氨基，其特征是采用一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基，另一端含有二硫键或N-琥珀酰亚胺基的异型偶联剂，将异型偶联剂与生物纳米磁小体反应，使磁小体连接二硫键或N-琥珀酰亚胺基，然后由以下三个途径之一得产品(1)将连接了二硫键或N-琥珀酰亚胺基的磁小体直接与含巯基的抗癌药物反应；(2)将含二硫键的抗癌药物与二硫苏糖醇反应使二硫键转化为巯基，再与连接了二硫键或N-琥珀酰亚胺基的磁小体反应；(3)连接了二硫键的磁小体与二硫苏糖醇反应使二硫键转化为巯基，然后与含二硫键的抗癌药物反应。
8.-种权利要求1的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，生物纳米磁小体脂膜和抗癌药物分别含有氨基，其特征是将生物纳米磁小体及抗癌药物分别与异型偶联剂反应，使磁小体及抗癌药物分别连接二硫键或一方连接二硫键另一方连接N-琥珀酰亚胺基，再将其中连接二硫键的一方与二硫苏糖醇反应而还原成巯基，然后与未还原的另一方反应，得产品；所说的异型偶联剂是一端含有醛基、羧基/酸酐、N-琥珀酰亚胺酯基、N-琥珀酰亚胺磺酸钠酯基或碳化二亚胺酯基，另一端含有二硫键或N-琥珀酰亚胺基的化合物。
9.根据权利要求8所述的生物纳米磁性靶向抗癌药物的制备方法，其特征是所说的异型偶联剂与抗癌药物或纳米磁小体中的一方反应之前，先与聚氨基酸、聚乙二醇或聚糖类聚合物反应，使偶联剂与聚合物连接，再与N-羟基丁二酰亚胺或1-乙基-3-(3-二甲氨正丙基)碳化二亚胺反应，使聚合物上的羧基转化为N-琥珀酰亚胺酯基或碳化二亚胺酯基，然后与该方原料反应。
10.根据权利要求3或4或5或6或7或8或9所述的方法，其特征是各步反应均在纯水或磷酸缓冲溶液中搅拌或间断地脉冲超声下进行，生物纳米磁小体的每次反应后产物均用磁铁吸出并纯水或缓冲溶液洗涤。
全文摘要
本发明涉及一种生物纳米磁性靶向抗癌药物，由生物纳米磁小体与抗癌化学药物偶联而成，生物纳米磁小体是趋磁细菌细胞内形成的纳米磁性颗粒，粒径35－120nm，主要成分为Fe
文档编号H01F1/032GK1927400SQ200610096409
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月25日 优先权日2006年9月25日
发明者唐喜庆 申请人:唐喜庆