包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性的制作方法

专利名称：：包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用寡核苷酸作为免疫刺激剂的免疫学和免疫治疗应用。相关领域的概述在现代分子生物学中寡核苷酸已经成为不可或缺的工具，应用于各种技术，包括从诊断探针方法到PCR到基因表达的反义抑制和免疫治疗应用。寡核苷酸的这种广泛使用导致对快速、廉价和高效合成寡核苷酸方法的需求不断增加。用于反义和诊断应用的寡核苷酸的合成现在可以常规地实现。参见，例^口,Afef/zocfeAfo/ecw/ar化/.20.'/Votoco/>ybrO/Zgowwc/eo/Zdes」"a/ogspp.165-189(S.Agrawal，ed"HumanaPress,1993);JMa/ogwas，爿/Vacrica/^p/roac/z，pp.87-108(F.Eckstein,ed.，1991);和UhlmannandPeyman,sw/ra,'AgrawalandIyer，Cw/r.Qp.5i她c/2.6:12(1995);和爿"toeme7&sea/r/z/^p///c<3f/ora(CrookeandLebleu,eds.，CRCPress,BocaRaton,1993)。早期的合成方法包括磷酸二酯和磷酸三酯化学法。例如，Khorana等人，/Mo/ec.所o/.72:209(1972)公开了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化学法。Reese,T^ra/2^/ra"丄e".34:3143-3179(1978),公开了用于寡核苷酸和多核香酸合成的磷酸三酯化学法。这些早期方法大部分已经被更有效的亚磷酰胺和H-膦酸酯(H-phosphonate)合成途径所取代。例如，Beaucage和Camthers,refra/zet/raw22:1859-1862(1981)，公开了脱氧核糖核苷亚磷酰胺在多核苦酸合成中的用途。Agrawal和Zamecnik，美国专利5,149,798(1992),公开了通过H-膦酸酯化合物方法的寡核苷酸优化合成。这两种现代方法已经用于合成具有各种^奮饰的核苷酸间耳关结的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild,Tefra/z^ra"丄故.28:3539-3542(1987),教导了利用亚磷酰胺化学法的寡核苷酸曱基膦酸酯合成。Connolly等人,5/oc/zem.23:3443(1984),公开了利用亚磷酰胺化学法的寡核苷酸硫代磷酸酯合成。Jager等人,所oc/zem.27:7237(1988)，公开了利用亚磷酰胺化学法的寡核苷酸氨基磷酸酯合成。Agrawal等人,尸rac.Ato/.5W.(T/S4)85:7079-7083(1988)，公开了利用H-膦酸酯化合物化学法的寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯的合成。最近，若干研究人员已经证明寡核苷酸在免疫治疗应用中用作免疫刺激剂的有效性。磷酸二酯和疏代磷酸酯寡核香酸能够诱导免疫刺激的观察结果引起了人们将这种副作用发展成为治疗手段的兴趣。这些努力聚焦于包含二核苷酸——天然CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸。Kuramoto等人，/Owcw83:1128-1131(1992)教导了包含含有CpG二核苷酸的回文结构的磷酸二酯寡核苷酸能够诱导干扰素-alpha和gamma的合成并增强天然杀伤活性。Krieg等人，371:546-549(1995)公开了包含硫代磷酸酯CpG的寡核苷酸具有免疫刺激活性。Liang等人，乂C//w./"ve"98:1119-1129(1996)公开了这类寡核苷酸活化人B细胞。Moldoveanu等人，)^cc/we16:1216-124(1998)教导了包含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增强抗流感病毒的免疫应答。McCluskie和Davis,//m柳w"o/.161:4463-4466(1998)教导了包含CpG的寡核苷酸作为强力的佐剂，增强抗乙型肝炎表面抗原的免疫应答。Hartman等人，J.Immunol164:1617-1624(2000)教导了免疫刺激序列是种属特异的，在小鼠和灵长类动物之间是不同的。对含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其他修饰还可能影响它们作为免疫应答调节剂的能力。参见，例如，Zhao等人，所oc/zem.尸/zarmaco/.(1996)51:173-182;Zhao等人，所0c/2ew尸/zawwfco/.(1996)52:1537-1544;Zhao等人，^"toeraeM/c/ez.c^4"ViZ)ragDev.(1997)7:495-502;Zhao等人，Me<i.CTze淤.丄e仏(1999)9:3453-3458;Zhao等人，Bz'oorg.CTzew.(2000)10:1051-1054;Yu等人，C7ze肌(2000)10:2585-2588;Yu等人，CTzew.(2001)11:2263-2267;和Kandimalla等人，MedCTzew.(2001)9:807-813。这些报道清楚表明仍然存在一种需要，以便能够调节免疫刺激性寡核苷酸造成的免疫应答并克服免疫刺激性序列的种属特异性。发明简述本发明提供用于调节寡核苷酸化合物造成的免疫应答的方法。本发明的方法能够用来改变免疫刺激性寡核苷酸产生的细胞因子分布i普(profile)，用于免疫治疗应用。本发明人出人意料地发现免疫刺激二核苷酸的修饰使产生的免疫应答性质可以具有灵活性，而且某些修饰克服了迄今为止观察到的免疫刺激序列的种属特异性。在第一个方面中，本发明提供具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，画TCG,AACG,TTCG广X-G,CTTG,CAAGCT-5，；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5';5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，；5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5';5，-TCAGTCGiTTAG-X-GATTG,CTGACT-5，；5'画TCG,TCG,TTAGA-X-AGATTG,CTG!CT曙5，和5'-CAGTCG,TTCAG-X-GACTTG,CTGAC-5，；其中G,=2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷(arabinoguanosine);和乂=甘油接头。在第二个方面中，本发明提供药物组合物。这些组合物包括本发明第一个方面公开的任意一种组合物和药学上可接受的载体。在第三个方面中，本发明提供一种在脊推动物中产生免疫应答的方法，5'-TCG!AACG,TTCG广X-G,CTTGCAAG'CT-5，；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，；5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，；5，陽CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5';5，-TCAGTCG,TTAG-X画GATTG,CTGACT-5，；5，-TCG,TCGiTTAGA誦X-AGATTG,CTG,CT-5，和5，-CAGTCGiTTCAG-X-GACTTGCTGAC-5';其中=2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和乂=甘油接头。在第四个方面中，本发明提供一种用于治疗患有癌症，自身免疫病症，气道炎症，炎性病症，皮肤病症，变态反应，哞喘或者病原体引起的疾病的脊推动物的方法，这种方法包括对患者施用具有来自下组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCG,AACG!TTCG广X-GiCTTGiCAAG!CT-5，；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，；5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5,;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5';5，-TCAGTCG!TTAG國X國GATTG!CTGACT-5，；5，-TCG!TCGTTAGA國X國AGATTG!CTG!CT画5，和5'陽CAGTCG!TTCAG画X-GACTTG，CTGAC-5，；其中G,-2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X-甘油接头。在第五个方面中，本发明提供一种用于在脊推动物中预防癌症，自身免疫病症，气道炎症，炎性病症，皮肤病症，变态反应，哮喘或者病原体引起刺激性寡核苷酸5'-TCG,AACGJTCG广X画GCTTG!CAAG,CT-5，；5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，；5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，；5，陽CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，；5，-TCAGTCGTTAG-X-GATTGCTGACT-5，；5，-TCG!TCG!TTAGA-X扁AGATTGCTG,CT-5,和5,-CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5，；其中G!:2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和乂=甘油接头。附图简述图1描述了适于本发明的免疫刺激性寡核苦酸的线性合成的一组典型的小分子接头。图2描述了适于本发明免疫刺激性寡核苷酸平行合成的一组典型的小分子接头。图3是用于本发明免疫刺激性寡核苷酸线性合成的合成方案。DMTr=4,4'-二曱氧三苯曱基;CE=氰乙基。图4是用于本发明免疫刺激性寡核苷酸平行合成的合成方案。DMTr=4,4'-二曱氧三苯曱基；CE=氰乙基。图5显示在HEK293细胞中本发明免疫刺激性寡核苷酸对TLR9的活化。图6显示在人pDC中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IFN-a的诱导。图7显示在人PBMCs中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IL-6的诱导。图8显示本发明免疫刺激性寡核苷酸对人B细胞的增殖作用(72小时)。图9显示在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中本发明免疫刺激性寡核苦酸对IL-12的诱导。图10显示在C57BL/6小鼠脾细胞培养物中本发明免疫刺激性寡核苷酸对IL-6的诱导。图11是寡核苷酸3'-端核苷的示意图，显示非核苷酸联结可附接于核苷的核石咸基处、3'位或者2'位上。优选实施方式详述本发明涉及寡核苷酸在免疫治疗应用中作为免疫刺激剂的治疗用途。本文通过提述并入本文引用的授权专利、专利申请和参考文献的全部内容，如同具体地和个别地写明将它们通过提述并入本文一样。在此处引用的任意文献的任意教导与本说明书不一致的情况下，说明书应优先用于本发明的目的。本发明提供增强免疫刺激性化合物引起的免疫应答的方法，所述免疫刺激化合物用于免疫治疗应用，例如，但不限于，在成体和幼体的人类和兽医应用中的癌症、自身免疫病症、哮喘、呼吸系统变态反应、食物过敏以及细菌、寄生虫和病毒感染的治疗。因此，本发明还提供对免疫治疗具有最佳免疫刺激作用水平的化合物，以及制备和使用这类化合物的方法。此外，本发明的化合物可以作为佐剂与DNA疫苗、抗体和变态反应原联用；以及和化疗剂和/或反义寡核苷酸联用。本发明人令人意外地发现，通过对免疫刺激性寡核苷酸进行修饰，使其5'端得到最优的展示，可对其免疫刺激能力产生显著影响。此外，本发明人发现，通过使用新的嘌呤或者嘧啶结构作为免疫刺激性寡核芬酸的一部分，能够调节免疫应答的细胞因子分布谱和种属特异性。在第一个方面中，本发明提供单独的或者包括至少两个寡核香酸的免疫刺激性寡核苷酸，所述至少两个寡核苷酸在它们的3'端处、或者核苦间联结(intemucleosidelinkage)处、或者官能化的核;威基处或者糖处与非核苦酸接头连接，其中至少一个寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸并具有易接近的5'端。此处所用的术语"易接近的5'端，，是指寡核苦酸的5'端是充分可用的，识别和结合寡核苷酸并刺激免疫系统的因子能够接近它。在具有易接近5'端的寡核苦酸中，末端糖的5'OH位置不与超过两个核苷残基或者任意其他干扰与5'端相互作用的模块共价连接。可选的是，5'OH可以连接于磷酸酯，硫代磷酸酯，或者二硫代磷酸酯模块，芳香族或者脂肪族接头，胆固醇，或者其他不干扰易接近性的实体。本发明的免疫刺激性寡核苷酸优选地还包括免疫刺激性二核苷酸，所述二核苷酸包括新的噤呤或者嘧啶。在某些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括核酶或者诱饰寡核苷酸。此处所用的术语"核酶，，是指具有催化活性的寡核苷酸。优选的，核酶结合特异的核酸靶标并切割靶标。本文中所用的术语"诱饵寡核苷酸"是指以序列特异性的方式结合转录因子并阻止转录活性的寡核苷酸。优选的，核酶或者诱饵寡核苷酸显示二级结构，包括，但不限于，茎-环或者发夹结构。在某些实施方式中，至少一个寡核苷酸包括聚(I)-聚(C)。在某些实施方式中，至少一组Nn包括一串3到10个dGs和/或Gs或者2'-取代的核糖或者阿糖Gs。对本发明来说，术语"寡核苷酸"是指由大量连接的核苷单位形成的多核苦(polynucleoside)。这类寡核苦酸可以从现有的核酸来源，包括基因组或者cDNA来源获得，但优选地通过合成方法产生。在优选的实施方式中，每个核苦单位包括杂环碱基和呋喃戊糖基(pentoforanosyl)、海藻糖、阿拉伯糖、2'-脱氧-2'取代阿拉伯糖、2'-0-取代阿拉伯糖或者己糖糖基团。核苷残基可以通过很多任意已知的核苷间联结彼此偶联。这类核苦间联结包括，但不限于，磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基磷酸酯，烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)，磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，烃氧羰基，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基曱酸酯，吗啉代，borano，硫醚，桥联磷酰胺脂，桥联亚曱基膦酸酯，桥联硫代磷酸酯，和砜核香间联结。术语"寡核苷酸"还包括具有一种或者多种立体特异核苷间联结(例如，(^)-或者(&)-硫代磷酸酯，烷基磷酸酯或者磷酸三酯联结)的多聚核苦。此处所用的术语"寡核苷酸"和"二核苷酸"明确旨在包括具有任意这类核苷间联结的多聚核普和二核苷，不管该联结是否包括磷酸基。在某些优选的实施方式中，这些核苷间联结可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯，或者二硫代磷酸酯联结，或者其组合。在一些实施方式中，每个寡核苷酸具有从大约3个到大约35个核苷残基，优选的从大约4个到大约30个核苷残基，更优选的从大约4个到大约20个核苷残基。在一些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括具有从大约5个到大约18个，或者从大约5个到大约14个核苷残基的寡核苷酸。此处所用的术语"大约"表示精确数目并不是关键的。因此，寡核苷酸中核苷残基的数目并不是关键的，少1个或者2个核苷残基的寡核苷酸，或者多l个到数个核苷残基的寡核苷酸被视作如上所述的每个实施方式的等同物。在一些实施方式中，一种或者多种寡核苷酸具有11个核苷酸。在免疫刺激性寡核苷酸的语境中，优选的实施方式具有从大约13个到大约35个核苷酸，更优选的从大约13个到大约26个核芬酸。术语"寡核苷酸"还包括具有其他取代基的多聚核苷，包括但不限于，蛋白基，亲脂性基，插入剂，二胺，叶酸，胆固醇和金刚烷。术语"寡核苷酸，，还包括任意其他包含核碱基的聚合物，包括但不限于，肽核酸(PNA)，具有磷酸基团的肽核酸(PHONA),锁定核酸(LNA),吗啉代-骨架寡核香酸，和具有包括烷基接头或者氨基接头的骨架部分的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，修饰的核苷或者其混合物。此处所用的术语"修饰核苦"是指包括修饰杂环碱基、修饰糖模块或者其组合的核苦。在一些实施方式中，修饰核苦是如此处描述的非天然嘧啶或者。票呤核苷。在一些实施方式中，修饰核苷是2'-取代核糖核苷，阿糖核苦或者2'-脱氧-2'-取代-阿拉伯糖苷。对本发明来说，术语"2'-取代核糖核苷"或者"2'-取代阿拉伯糖苷"包括这样的核糖核香或者阿糖核苷，其中戊糖模块的2'位的轻基被取代产生2'-取代的或者2'-0-取代的核糖核苷。优选的，这类取代是用包含1-6个饱和或者不饱和的碳原子的低级烷基，或者为具有6-10个碳原子的芳基取代，其中这类烷基或者芳基可以是未取代的，或者可以是取代的，例如被卣素、羟基、三氟曱基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或者氨基取代。2'-0-取代核糖核芬或者2'-0-取代-阿拉伯糖苷的实例包括但不限于2'-0-曱基核糖核苷或者2'-0-曱基阿拉伯糖苷和2'-0-曱氧乙基核糖核苷或者2'-0-曱氧乙基阿拉伯糖苷。术语"2'-取代核糖核苷"或者"2'-取代阿拉伯糖苷"还包括这样的核糖核苷或者阿糖核苷，其中2'-羟基被替换为包含1-6个饱和或者不饱和碳原子的低级烷基，或者氨基或卣素基团。这类2'-取代核糖核苷或者2'-取代阿拉伯糖苷的实例包括但不限于，2'-氨基，2'-氟代，2'-烯丙基和2'-炔丙基核糖核苷或者阿拉伯糖苷。术语"寡核苷酸"包括杂交和嵌合寡核苷酸。"嵌合寡核苷酸"是指具有超过一种类型的核苷间联结的寡核苷酸。这类嵌合寡核苷酸的优选实例之一是包括硫代磷酸酯、磷酸二酯或者二硫代磷酸酯区域和非离子联结例如烷基磷酸酯或者烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)联结的嵌合寡核苷酸(参见，Pederson等人美国专利5,635,377和5,366,878)。"杂交寡核苷酸"是指具有超过一种类型的核苷的寡核苷酸。这类杂交寡核苷酸的一个优选实例包括核糖核苷酸或者2'-取代核糖核苷酸区域，以及脱氧核糖核苦酸区域(参见，例如，Metelev和Agrawal，美国专利5,652,355,6，346，614和6,143,881)。对本发明来说，术语"免疫刺激性寡核苷酸"是指如上所述的寡核苷酸，当将其施用于脊推动物例如鱼、家禽或者哺乳动物时，其诱导免疫应答。此处所用的术语"哺乳动物"包括但不限于大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛(cattle)、奶牛(cows)、猪、兔、非人灵长类动物和人。有用的免疫刺激性寡核苷酸可参见于Agrawal等人在1998年11月5日公开的WO98/49288;2001年2月22日公开的WO01/12804;2001年8月2日公开的WO01/55370;2001年4月30日提交的PCT/US01/13682;和2001年9月26日提交的PCT/US01/30137中的描述。优选的，免疫刺激性寡核苷酸包括至少一个磷酸二酯，硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯核苷间联结。在一些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括式5'-Pyr-Pur-3'所示的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然或者合成的嘧啶核苷，Pur是天然或者合成的噪呤核苷。在一些优选的实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括式5'-Pur、Pur-3'所示的免疫刺激性二核苦酸，其中Pu一是合成的噪呤核苷，Pur是天然或者合成的嘌呤核苷。在不同的地方二核苷酸表达为RpG，C^pG或者YZ，在这种情况下R、(3*或者Y分别代表合成嘌呤。尤其优选的合成嘌呤是2-氧代-7-脱氮-8-曱基-噪呤。当该合成。票呤位于二核苷酸的Pu一位置时，可克服免疫刺激作用的种属特异性(序列依赖性)并且改善细胞因子分布谱。此处所用的术语"嘧啶核苷"是指这样的核苷，其中核苷的碱基组分是单环核碱基。类似地，术语"嘧啶核香"是指一种这样的核苷，其中核苷的碱基组分是双环核碱基。对本发明来说，"合成的"嘧啶或者噤呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤碱基、非天然存在的糖模块、或者它们的组合。本发明优选的嘧啶核苷具有结构(/):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中D是氢键供体；D'选自氢、氢键供体、氢4建受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；A是氬键受体或者亲水基；A'选自氢键受体、亲水基、疏水基、吸电子基团和给电子基团；X是碳或者氮；和S'是戊糖或者己糖糖环，或者非天然存在的糖。优选的，糖环被磷酸酯模块、修饰的磷酸酯模块、或者适于将嘧啶核苷连接到另一个核苷或者核苷类似物的其他接头模块所衍生化。优选的氢键供体包括但不限于，-NH-，-NH2,-SH和-OH。优选的氢键受体包括但不限于，C=0、C-S和芳族杂环的环氮原子，例如，胞嘧啶的N3。在一些实施方式中，(/)中的碱基模块是非天然存在的嘧啶碱基。优选的非天然存在的嘧咬碱基的实例包括，但不限于，5-羟基胞嘧啶，5-羟曱基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，优选N4-乙基胞嗜咬和4-硫尿嘧咬。但是，在一些实施方式中，5-溴胞嘧啶特别被排除在外。在一些实施方式中，(/)中的糖模块S'是非天然存在的糖模块。对本发明来说，"天然存在的糖基"是天然作为核酸一部分存在的糖模块，例如，核糖和2'-脱氧核糖，而"非天然存在的糖模块"是指不是天然作为核酸一部分存在，但可用于寡核苷酸的骨架的任意糖，例如，己糖。阿拉伯糖和阿拉伯糖衍生物是优选糖模块的实例。本发明优选的嘌呤核苷类似物具有结构(/7):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中D是氬键供体；D'选自氢、氬键供体和亲水基；A是氢键受体或者亲水基；X是碳或者氮；各个L是独立选自C、O、N和S的原子；和S'是戊糖或者己糖糖环，或者非天然存在的糖。优选的，糖环被磷酸酯模块，修饰的磷酸酯模块，或者适于将嘧啶核苷连接到另一个核苷或者核苷类似物的其他接头模块所衍生化。优选的氢4建供体包括但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。优选的氢键受体包括，但不限于，C=0、C=S、-N02和芳族杂环的环氮原子，例如，鸟喋呤的Nl。在一些实施方式中，(/i)中的碱基模块是非天然存在的噪呤碱基。优选的非天然存在的噪呤碱基的实例包括，但不限于，2-氨基-6-硫代。票呤和2-氨基-6-氧代-7-脱氮噪呤。在一些实施方式中，(J/)中的糖模块S'在是天然存在的糖模块，如上面对结构(7)的描述。在优选的实施方式中，免疫刺激性二核苷酸选自CpG,C*pG,CpG=^。C*pG*，其中C的碱基是胞嘧啶，<:*的碱基是2'-胸腺嘧啶，5-羟基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶，4-石克尿嘧啶或者其他非天然的嘧啶，或者2-氧代-7脱氮-8-甲基嗓呤，其中当碱基是2-氧代-7-脱氮-8-甲基嘌呤时，它优选的通过碱基的1位与戊糖的l'-位共价结合；G的石成基是鸟苷(guanosine),0*的碱基是2-氨基-6-氧代-7-脱氮噤呤，2-氧代-7-脱氮-8-曱基。票呤，6-硫代鸟嘌呤，6-氧代嘌呤，或者其他非天然的嘌呤核苷，p是选自磷酸二酯，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷间联结。在某些优选的实施方式中，免疫刺激性二核苷酸不是CpG。免疫刺激性寡核苷酸可以在免疫剌激性二核苷酸的一边或者两边包括免疫刺激模块。因此，在一些实施方式中，免疫刺激性寡核苷酸包括结构(///)的免疫刺激域5，-Nn陽Nl-Y画Z-Nl-Nn-3'(///)其中Y的碱基是胞嘧啶、胸腺嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-烷基-胞嘧啶、4-硫尿嘧啶或者其他非天然的嘧啶核苷，或者2-氧代-7-脱氮-8-曱基-嘌呤，其中当碱基是2-氧代-7-脱氮-8-曱基-噤呤时，它优选的通过碱基的1位与戊糖的r位共价结合；Z的碱基是鸟嘌呤、2-氨基-6-氧代-7-脱氮嘌呤、2-氧代-7-脱氮-8曱基嘌呤、2-氨基-6-硫代-嘌呤、6-氧代嘌呤或者其他非天然的嘌呤核苷；Nl和Nn，每次出现时相互独立优选的是选自下组的天然存在或者合成的核苦或者免疫刺激模块无碱基(abasic)核苷，阿糖核苷，2'-脱氧尿苷，a-脱氧核糖核苷，(3-L-脱氧核糖核苦，和通过磷酸二酯或者修饰的核苷间联结与3'侧的相邻核苷连接的核苷，修饰的核苷酸间联结选自，但不限于，具有长度从大约2埃到大约200埃的接头，C2-C18烷基接头，聚(乙二醇)接头，2-氨基丁基-l,3-丙二醇接头，甘油基接头，2'-5'核苷间联结，和硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，或者甲基膦酸酯核苷间联结；条件是至少一个Nl或者Nn可选地是免疫刺激模块；其中n是从0到30的数字；和其中3'端、核苷间接头、或者衍生化的核^5成基或者糖与另一个寡核苷酸直接连接或者通过非核苷酸接头连接，该寡核苷酸可以是也可以不是免疫刺激性的。在一些优选的实施方式中，YZ是阿糖胞苷(arabinocytidine)或者2'-脱氧-2'-取代阿糖胞香和阿糖鸟苷(arabinoguanosine)或者2'-脱氧-2'-取代阿糖鸟苦。优选的免疫刺激模块包括天然磷酸二酯骨架和在磷酸酯骨架中的修饰，包括，但不限于，曱基膦酸酯、曱基硫代膦酸酯、磷酸三酯、磷酸硫代三酯(phosphothiotriesters)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前体药物、砜、氨磺酰、氨基磺酸盐、曱缩醛(formacetal)、N-曱基羟胺、碳酸酯、氨基曱酸酯、吗啉代、boranophosphonate、氨基磷酸酯，特别是伯氨基-氨基磷酸酯、N3氨基磷酸酯和N5氨基磷酸酯，和立体特异性的联结(例如，(i》-或者(5V))-硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、或者磷酸三酯联结)。本发明优选的免疫刺激模块还包括具有糖修饰的核苷，包括，但不限于，2'-取代的戊糖，包括但不限于，2'-0-曱基核糖、2'-0-曱氧乙基核糖、2'-0-炔丙基核糖和2'-脱氧-2'-氟代核糖；3'-取代的戊糖，包括，但不限于，3'-0-曱基核糖；l',2'-双脱氧核糖；阿拉伯糖；取代的阿拉伯糖，包括，但不限于，l'-甲基阿拉伯糖、3'-羟曱基阿拉伯糖、4'-羟曱基阿拉伯糖、3'-羟基阿拉伯糖和2'-取代的阿拉伯糖；己糖，包括，但不限于，1,5-脱水己糖醇，和alpha-异头物(anomers)。在修饰糖是3'-脱氧核糖核苷或者3'-0-取代核糖核苷的实施方式中，免疫刺激模块通过2'-5'核苷间联结连接到相邻的核苷。本发明优选的免疫刺激模块还包括具有其他糖类骨架修饰和替换的寡核苷酸，包括肽核酸(PNA)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、锁定核酸(LNA)、吗啉代骨架修饰和具有长度从大约2埃到大约200埃的骨架接头部分的寡核苷酸，所述接头包括但不限于，烷基接头或者氨基接头。烷基接头可以是分支化或者无分支的，取代或者未取代的，和手性纯或者外消旋混合物。最优选的，这类烷基接头具有从大约2个到大约18个碳原子。在一些优选的实施方式中这类烷基接头具有从大约3个到9个碳原子。一些烷基接头包括选自羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、S旨、脲和硫醚的一种或者多种官能团。一些这类官能化烷基接头是式-0(CH2-CH2-0-)n(n=l-9)所示的聚(乙二醇)接头。一些其他官能化的烷基接头是肽或者氨基酸。本发明优选的免疫刺激模块还包括DNA亚型，包括，但不限于，J3-L-脱氧核糖核苷和a-脱氧核糖核苷。本发明优选的免疫刺激模块包括3'修饰，并且还包括具有非天然的核苦间联结位置，包括但不限于，2，-5'、2'-2'、3，-3，和5，-5，联结，的核苷。本发明优选的免疫刺激模块还包括具有修饰杂环碱基的核苷，包括，但不限于，5-羟基胞嘧啶、5-羟曱基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶，优选的是N4-乙基胞嘧啶、4-石克尿嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、肌苷、硝基吡咯、C5-丙炔基嘧咬、和二氨基噪呤，包括，但不限于，2，6-二氨基嘌呤。作为具体说明而不是限制，例如，在结构(m)的免疫刺激域中，在位置Nl或者Nn的甲基膦酸酯核苷间联结是免疫刺激模块，具有大约2埃到大约200埃长度的接头一一位置XI的C2-C18烷基接头是免疫刺激模块，位置XI的(3-L-脱氧核糖核苷是免疫刺激模块。参见下面表1中免疫刺激模块的典型位置和结构。应理解的是，称某一接头为某一特定位置的免疫刺激模块，是指该位置的核苷残基在其3'-羟基处被所指的接头取代，从而在该核苷残基和其3'侧的相邻核普之间产生修饰的核苷间联结。类似地，称某一修饰核苷间联结为某一特定位置处的免疫刺激模块，是指该位置的核苷残基通过所述联结与相邻核苷在3'侧连接。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2显示具有上游增强域的免疫刺激性寡核苷酸内免疫刺激模块的典型位置和结构。此处所用的术语"间隔团9"是指如式-0-((^2092-0)-所示的聚(乙二醇)接头，其中n是3。术语"间隔团18"是指如式为-0-(CH2CH2-0)"-所示的聚(乙二醇)接头，其中n是6。此处所用的术语"C2-C18烷基接头"是指如式-0-(CH2),-0-所示的接头，其中《是从2到18的整数。因此，术语"03-接头"和"C3-烷基接头"是指化学式为-0-(CH2)3-0-的接头。对间隔团9、间隔团18和C2-C18烷基接头中的每一个而言，接头通过磷酸二酯、硫代磷酸酯或者二》充代磷酸酯联结与相邻的核苷连接。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3显示具有下游增强域的免疫刺激性寡核苦酸内免疫刺激模块的典型位置和结构。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>本发明的免疫刺激性寡核苷酸包括至少两个寡核苷酸，它们在其3'端或者核香间联结处、或者官能化的核》咸基处、或者糖处通过非核苷酸接头连接。对本发明来说，"非核苷酸接头"是指能够通过共价或者非共价键与寡核苷酸连接的任意基团。优选的这类接头长度从大约2埃到大约200埃。下面阐明几个优选的接头实例。非共价键包括，但不限于，静电相互作用，疏水性相互作用，兀堆积相互作用，和氢^y定合。术语"非核苷酸接头"不是用来指如上所述的直接连接两个核苷的3'羟基的核苦间联结，例如磷酸二酯，硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯官能团。对本发明来说，这类直接的3'-3'联结(没有接头参与)被认为是"核苷酸联结"。在一些实施方式中，非核苷酸接头是金属，包括但不限于金颗粒。在其他的实施方式中，非核苦酸接头是可溶性或者不溶性生物可降解的聚合物珠子。在其它实施方式中，非核苷酸接头是具有用于结合寡核苷酸的官能团的有机模块。这类连接优选的通过任意稳定的共价键。作为非限制性的实例，接头可以结合到核苦上的任意合适位置，如图ll所示。在一些优选的实施方式中，接头附接于3'-羟基。在这类实施方式中，接头优选地包括羟基官能团，该羟基官能团优选地通过基于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或者非磷酸酯的联结而附接于3'-羟基。在一些实施方式中，非核苷酸接头是生物分子，包括，但不限于，多肽、抗体、类脂、抗原、变态反应原和低聚糖。在一些其他的实施方式中，非核苷酸接头是小分子。对本发明来说，小分子是分子量小于1,000Da的有机基团。在一些实施方式中，小分子的分子量小于750Da。在一些实施方式中，小分子是脂肪烃或者芳烃，所述脂肪烃或者芳烃可任选地包括一种或者多种选自羟基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲和硫脲的官能团，所述官能团或者位于连接寡核苷酸的直链中，或者附接于其上。小分子可以是环状或者非环状的。小分子接头的实例包括，但不限于，氨基酸、糖、环糊精、金刚烷、胆固醇、半抗原和抗生素。但是，对描述非核香酸接头来说，术语"小分子"不应包括核苷。在一些实施方式中，小分子接头是如式HO-(CH2)。-CH(OHHCH2VOH所示的甘油或者甘油同系物，其中o和p独立地是从1到大约6，从l到大约4或者从1到大约3之间的整数。在一些其他的实施方式中，小分子接头是1,3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。这类衍生物中的一些具有化学式HO-(CH2)m-C(0)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(0)-(CH2)m-OH,其中m是0到大约10，0到大约6，2到大约6或者2到大约4之间的整数。本发明的一些非核苷酸接头容许超过两个寡核苷酸的连接。例如，小分子接头甘油具有可供寡核苷酸共价连接的3个羟基。因此，本发明的一些免疫刺激性寡核苷酸包括超过两个寡核苷酸，它们在其3'端与非核苷酸接头连接。利用自动化合成仪和亚磷酰胺方法(如图3和4的示意图所示，在实施例中进一步描述)，可以方便地合成本发明的免疫刺激性寡核苷酸。在一些实施方式中，通过线性合成方法合成免疫刺激性寡核苷酸(参见图3)。此处所用的术语"线性合成"是指从免疫刺激性寡核苷酸的一端开始，线性推进到另一端的合成。线性合成允许在免疫刺激性寡核苷酸中掺入相同或者不同(就掺入的长度、碱基组成和/或化学修饰而言)的单体单元。另一种合成方式是"平行合成"，其中合成从中央接头基团向外进行(参见图4)。附接在固相支持物上的接头可以用于平行合成，如美国专利5,912,332所述。此外，可以使用通用的固相支持物(例如磷酸酯附接的可控孔径玻璃)。免疫刺激性寡核苷酸的平行合成相对于线性合成具有几个优点:(l)平行合成容许掺入相同的单体单元；(2)与线性合成不同，所有的单体单元都是同时合成，因此合成步骤的数目和合成需要的时间与一个单体单元的相同；和(3)合成步骤的减少使最终的免疫刺激性寡核苷酸产物的纯度和产量增加。在依照线性合成或者平行合成规程进行的合成结束时，利用浓的氨溶液或者根据亚磷酰胺供应商的推荐可以方便的对免疫刺激性寡核苷酸进行脱保护，如果掺入了修饰核苷的话。对产物寡核苷酸优选地利用反相HPLC纯化，脱三苯曱基，脱盐和透析。表4显示本发明典型的免疫刺激性寡核芬酸。表4.免疫刺激性寡核苷酸序列的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>G,-2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷(araguanosine);X=甘油接头在第二个方面中，本发明提供包括上述免疫刺激性寡核苷酸和抗原的免疫刺激性寡核苷酸偶联物，所述抗原与免疫刺激性寡核苷酸在不同于易接近的5'端的位置偶联。在一些实施方式中，非核苷酸接头包括抗原，其偶联于寡核苦酸。在一些其他的实施方式中，抗原与寡核苷酸在不同于其3'端的位置偶联。在一些实施方式中，抗原产生疫苗效果。抗原优选地选自与病原体相关的抗原，与癌症相关的抗原，与自身免疫病症相关的抗原，和与其他疾病，例如但不限于兽医或者儿科疾病相关的抗原。对本发明来说，术语"与...相关的"表示当病原体、癌症、自身免疫病症、食物过敏、呼吸变态反应、哮喘或者其他疾病存在时，抗原也存在，但当病原体、癌症、自身免疫病症、食物过敏、呼吸变态反应或者疾病不存在时，抗原不存在或者减量存在。免疫刺激性寡核苷酸与抗原共价连接，或者它与抗原另外可操作地结合(operativelyassociated).此处所用的术语"与...可操作地结合"是指保持免疫刺激性寡核苷酸和抗原活性的任意结合(association)。这样的"可操作结合"的非限制性实例包括构成同一脂质体或者其他此类投递载体或者试剂的部分(beingpartofthesameliposomeorothersuchdeliveryvehicleorreagent)。在免疫刺激性寡核苷酸共价连接到抗原的实施方式中，这类共价联结优选位于免疫刺激性寡核苷酸上的任意位置，除了免疫刺激性寡核苷酸易接近的5'端之外。例如，抗原可以在核苷间联结附接或者可以连接到非核苷酸接头。此外，抗原本身可以是非核苷酸接头。第三个方面，本发明提供包括本发明的免疫剌激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物和生理上可接受的载体的药物制剂。此处所用的术语"生理上可接受的"是指材料不干扰免疫刺激性寡核苷酸的有效性，并且与生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或者生物体相容。优选的，生物系统是活的生物，例如脊推动物。此处所用的术语"载体"包括任意赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、緩沖剂、稳定剂、增溶剂、类脂、或者本领域公知的用于药物制剂的其他材料。应了解载体、赋形剂或者稀释剂的性质将取决于针对特殊应用的给药途径。包含这些材料的药学上可接受的制剂的制备描述于，例如，^m/"gto"^尸/za環acewZ7'ca/iSWe"cey，18thEdition,ed.A.Gennaro，MackPublishingCo.，Easton,PA,1990。在第四个方面中，本发明提供在脊推动物中产生免疫应答的方法，这种方法包括对脊推动物施用本发明的免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物。在一些实施方式中，脊推动物是哺乳动物。对本发明来说，术语"哺乳动物"明确地意图包括人。在优选的实施方式中，对需要免疫刺激的脊推动物施用所述免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物。在本发明这方面的方法中，免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物的给药可以通过任何合适的途径，包括但不限于非消化道、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪，皮肤贴片或者采用滴眼液或者漱口剂形式。可使用已知的程序，以有效减少疾病的症状或替代标记物的剂量和时间段进行免疫刺激性寡核苷酸治疗组合物的施用。当全身给药时，优选施用足够剂量的治疗组合物以便免疫刺激性寡核苷酸的血液水平达到从大约0.0001微摩尔到大约IO微摩尔。对于局部给药，比这低得多的浓度也可能是有效的，而高得多的浓度也可能是可耐受的。优选的，免疫刺激性寡核苷酸的总剂量从大约0.001mg每个患者每天到大约200mg每千克体重每天。可能需要同时或者连续地对个体施用治疗有效量的一种或者多种本发明的治疗组合物作为单一治疗段落。在某些优选的实施方式中，本发明的免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物与疫苗、抗体、细胞毒剂、变态反应原、抗生素、反义寡核苷酸、肽、蛋白、基因治疗载体、DNA疫苗和/或佐剂联合给药以增强免疫应答的特异性或者大小。在这些实施方式中，本发明免疫刺激性寡核苷酸可以不同地充当佐剂和/或产生直接免疫刺激作用。免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸偶联物或者疫苗可任选地连接免疫原性蛋白，例如钥孔血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基、或者任意其他免疫原性载体蛋白。可以使用多种佐剂中的任何种，包括但不限于，弗氏完全佐剂、KLH、单磷酰类脂A(MPL)、明矾和皂苷，包括QS-21、咪喹莫特(imiquimod)、R848、或者它们的组令。对本发明的这方面来说，术语"与...联合"意思是在治疗相同患者的相同疾病的过程中，包括以任意顺序施用免疫刺激性寡核苷酸和/或疫苗和/或佐剂，包括同时施用，和以时间上分隔的顺序(多至相隔几天)施用。这种联合治疗还可以包括施用免疫刺激性寡核苷酸，和/或独立地施用疫苗，和/或独立地施用佐剂多于一次。免疫刺激性寡核苷酸和/或疫苗和/或佐剂可以通过相同或者不同的途径施用。本发明这方面的方法可用于免疫系统的^t型研究。该方法还可用于人或者动物疾病的预防或者治疗。例如，该方法可用于儿科用和兽用疫苗应用。第五个方面，本发明提供治疗性处理患有疾病或者病症的患者的方法，这种方法包括对患者施用本发明的免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苦酸偶联物。在不同的实施方式中，待治疗的疾病或者病症是癌症，自身免疫病症，气道炎症，炎性病症，变态反应，哮喘或者病原体引起的疾病。病原体包括细菌，寄生虫，真菌，病毒，类病毒和朊病毒。按照本发明第四个方面的描述进行施用。对本发明来说，术语"变态反应"包括，但不限于，食物变态反应和呼吸系统变态反应。术语"气道炎症"包括，但不限于，哮喘。此处所用的术语"自身免疫病症"是指"自身"蛋白遭受免疫系统攻击的病症。该术语包括自身免疫哮喘。在根据本发明的这个方面的任意方法中，免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物可以与有用于治疗疾病或者病症而不降低免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激作用的任意其他试剂联合施用。例如，在癌症的治疗中，预期免疫刺激性寡核苷酸或者免疫刺激性寡核苷酸偶联物可以与化疗化合物联合施用。下面的实施例旨在进一步说明本发明的某些优选实施方式，而不是意图限定本发明的范围。实施例实施例1:包含免疫刺激模块的寡核苷酸的合成利用自动化DNA合成仪(OligoPilotII,AKTA,(Amersham)和/或Expedite8909(AppliedBiosystem))，按照图3和4所列的线性合成或者平行合成程序，以1|imol到0.1mM的规模合成寡核苷酸。5，-DMTdA、dG、dC和T亚磷酰胺购自Proligo(Boulder,CO)。5，-DMT7-脱氮-dG和araG亚石粦酰胺获自Chemgenes(Wilmington,MA)。DiDMT-甘油接头固相支持物获自Chemgenes。l-(2，-脱氧-(3-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脱氮-8-曱基-噤呤亚磷酰胺(1—(2,-deoxy-J3-D-ribofUranosyl)-2-oxo-7-deaza—8-methyl—purineamidite)双自GlenResearch(Sterling,VA)，2，-0-曱基核糖核苦亚磷酰胺(2'画0-methylribonuncleosideamidites)获自Promega(Obispo，CA)。所有的寡核苷酸都是疏代磷酸酯骨架修饰的。所有的核苷亚磷酰胺均通过"P和H核磁共振语表征。利用供应商推荐的常规偶联循环在特定位点掺入修饰的核苷。合成以后，利用浓氢氧化铵对寡核苷酸进行脱保护，然后通过反相HPLC纯化、脱三苯曱基、继之以透析。纯化的寡核苷酸在使用前以钠盐形式冻干。通过CGE和MALDI-TOFMS检验纯度。内毒素水平通过LAL试验测定低于1.0EU/mg。实施例2:TLRs的活化将HEK293/mTLR9细胞(Invivogen,SanDiego，CA)培养在5%002培养箱中的48孔平板中，其中每孔250pi的DMEM,添加有10%热灭活的FBS。在80%汇合时，在培养基中存在4|il/mlLipofectamine(Invitrogen，CA)的条件下，将培养物用400ng/ml的Seap报道质粒(pNifty^Seap)(SanDiegoCA)瞬时转化。在不含血清的培养基中分别稀释质粒DNA和Lipofectamine,并在室温孵育5分钟。孵育之后，混合稀释的DNA和Lipofectamine,再将混合物在室温孵育20分钟。将含有100ng质粒DNA和1piLipofectamine的25|ilDNA/Lipofectamine混合物添加至细胞培养平板的各个孔，继续培养4小时。转化之后，将培养基用新鲜的培养基置换，如下向培养物添加刺激性寡核苷酸(stimulating0ligo)和^卩制'l"生寡才亥香酸(inhibitoryoligo):0.5pg/ml的刺激性寡核苦酸，加O、0.25、0.5、2.0、5.0吗/ml的抑制性.寡核苷酸；继续培养18小时。在寡核苦酸处理结束时，从每个处理取30^的培养物上清用于SEAP分析。根据制造商的规程(Invivogen)来进行所述分析。用酶标仪在405nm^企测信号。用培养基对照(处理OD-培养基OD)将全部OD读数标准化，并且以PBS对照的倍凄t来表示NF-kB活性(标准化处理/标准化PBS)。。/。活性的计算是以刺激性寡核苷酸x0.5吗组作为100%,而将全部其它处理组作为该刺激性寡核苷酸x0.5吗组的百分比。结果示于图5。实施例3:人pDC中的IFN-ct诱导利用Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077,Sigma)从新鲜采集的健康志愿者血液(CBRLaboratories,Boston,MA)中分离外周血单核细胞(PBMCs)。根据制造商的说明书利用BDCA4细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)通过正选择从PBMCs分离pDCs。将pDCs以1x106细胞/ml铺于96孔皿。向细胞培养物中添加溶于DPBS(pH7.4;Mediatech)的IMO至终浓度为10.0吗/ml。然后将细胞在37。C孵育24小时，收集上清用于ELISA分析。各实验进行一式3孔的重复。通过夹心ELISA测定IFN-a的水平。所需的试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自PharMingen。结果示于图6。实施例4:人PMBCs中IMO对细胞因子的诱导将人PBMCs以5x106细胞/ml接种于48孔板。向细胞培养物中添加溶于DPBS(pH7.4;Mediatech)的IMO至终浓度为10.0(ig/ml。然后将细胞在37。C孵育24小时，收集上清用于ELISA分析。各实验进行一式3孔重复。通过夹心ELISA测定IL-6的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自PharMingen。结果示于图7。实施例5:人B细胞增殖用于分析的培养基的组成为RPMI1640培养基，添加有1.5mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、50|oM2-巯基乙醇、100IU/ml青霉素-链霉素合剂和10%热灭活的胎牛血清。在96孔平底板中对总共每ml0,5x106个B细胞(即1x105/200i!l/孔)用不同浓度的待测寡核苷酸刺激，一式3份重复，为时共72小时。66小时后，在每孔20plRPMI1640培养基(无血清)中将细胞用0.75pCi的[3H]-胸腺嘧咬核苷(lCi=37GBq;PerkinElmerLifeSciences)脉冲刺激(pulse)，8小时后收获。其后利用细胞收集器收获平板，并利用标准液体闪烁技术测定放射性掺入。结果示于图8，表示为平均cpm+/-SD或者增殖指数(cpm处理组/cpm培养基对照)。实施例6:小鼠脾细胞培养物中的细胞因子诱导制备来自4-8周龄BALB/c或者C57BL/6小鼠的脾细胞，培养在RPMI完全培养基中。将小鼠脾细胞以5X106细胞/ml接种在24孔培养i中。向细胞培养物中添加溶于TE緩沖液(10mMTris-HCL,pH7.5,1mMEDTA)的IMOs至终浓度为0.03、0.1、1.0、3.0或10pg/ml。然后将细胞在37。C孵育24小时，收集上清用于ELISA分析。通过夹心ELISA测定上清中IL-12和IL-6的水平。所需试剂，包括细胞因子抗体和标准品，均购自BDPharMingen。Streptavidin-Peroxidase和底物来自KPL。结果示于图9和10。等同物尽管为了清楚和理解的目的，已经对上述发明进行了一定程度的详细描述，但通过阅读本文本领域技术人员应当了解在形式和细节方面可以做出不脱离本发明和附属权利要求实质范围的各种变化。权利要求1.一种免疫刺激性寡核苷酸，具有来自下列组的结构5’-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5’；5’-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5’；5’-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5’；5’-TCAGTCG1TTAG-X-GATTG1CTGACT-5’；5’-TCG1TCG1TTAGA-X-AGATTG1CTG1CT-5’和5’-CAGTCG1TTCAG-X-GACTTG1CTGAC-5’；其中G1＝2’-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2＝阿糖鸟苷；和X＝甘油接头。2.—种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5,-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5,。3.—种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，。4.一种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'。5.—种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5，陽TCAGTCG!TTAG-X画GATTGCTGACT-5'。6.—种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苷酸，具有结构5'-TCGiTCG,TTAGA-X-AGATTG,CTG,CT-5，。7.—种如权利要求1所述的免疫刺激性寡核苦酸，具有结构5'-CAGTCG,TTCAG-X画GACTTGCTGAC-5'。8.—种药物制剂，包括如权利要求1所述的寡核苷酸和生理上可接受的载体。9.一种用于在脊推动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括对脊推动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5';5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5,;5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5';5，-TCAGTCG!TTAG-X-GATTG!CTGACT-5';5，-TCG,TCG!TTAGA-X-AGATTGCTG,CT-5，和5，-CAGTCG!TTCAG-X-GACTTG,CTGAC-5';其中G,-2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X-甘油接头。10.如权利要求9所述的方法，其中施用途径选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱口剂。11.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，的免疫刺激性寡核香酸。12.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，的免疫刺激性寡核苦酸。13.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，的免疫刺激性寡核苦酸。14.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5'-TCAGTCG，TTAG-X-GATTG,CTGACT-5，的免疫刺激性寡核苦酸。15.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5'-TCG,TCG,TTAGA-X-AGATTGiCTG!CT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。16.如权利要求9所述的方法，包括施用具有结构5'-CAGTCG,TTCAG-X-GACTTG,CTGAC-5，的免疫刺激性寡核芬酸。17.—种用于治疗患有癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哮喘或者病原体引起的疾病的脊推动物的方法，该方法包括对患者施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5';5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，；5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5'j5，-TCAGTCG!TTAG-X誦GATTG,CTGACT-5，；5，-TCGiTCG'TTAGA画X-AGATTG!CTGiCT-5，和5，-CAGTCG,TTCAG-X-GACTTG^TGAC-5';其中G!二2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和X二甘油接头。18.如权利要求17所述的方法，其中施用途径选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、目艮内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱口剂。19.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。20.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5'-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。21.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，的免疫刺激性寡核苷酸。22.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5'-TCAGTCG，TTAG-X-GATTG,CTGACT-5，的免疫刺激性寡核苦酸。23.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5，-TCG,TCG!TTAGA-X-AGATTG,CTG，CT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。24.如权利要求17所述的方法，包括施用具有结构5，-CAGTCG,TTCAG-X-GACTTG!CTGAC-5，的免疫刺激性寡核苷酸。25.—种用于在脊推动物中预防癌症、自身免疫病症、气道炎症、炎性病症、皮肤病症、变态反应、哞喘或者病原体引起的疾病的方法，这种方法包括对脊稚动物施用具有来自下列组的结构的免疫刺激性寡核苷酸5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，；5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，；5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5';5，-TCAGTCGTTAG画X-GATTGiCTGACT-5，；5'-TCG,TCG,TTAGA-X-AGATTGiCTG!CT-5，和5'-CAGTCGJTCAG-X-GACTTG,CTGAC画5，；其中G,=2，-脱氧-7-脱氮鸟苷；G2=阿糖鸟苷；和乂=甘油接头。26.如权利要求25所述的方法，其中施用途径选自非消化道、口服、舌下、经皮、局部、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、基因枪、皮肤贴片、滴眼液和漱口剂。27.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5，-TCAGTCG2TTAG-X-GATTG2CTGACT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。28.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5，-TCG2TCG2TTAGA-X-AGATTG2CTG2CT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。29.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5，-CAGTCG2TTCAG-X-GACTTG2CTGAC-5，的免疫刺激性寡核香酸。30.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5，-TCAGTCG,TTAG-X-GATTG,CTGACT-5，的免疫刺激性寡核苷酸。31.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5，-TCG,TCGTTAGA-X-AGATTG,CTG,CT-5，的免疫刺激性寡核苦酸。32.如权利要求25所述的方法，包括施用具有结构5'-CAGTCGJTCAG-X-GACTTGiCTGAC-5，的免疫刺激性寡核苦酸。33.如权利要求1所述的寡核苦酸，还包括抗体、反义寡核苦酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。34.如权利要求8所述的药物组合物，还包括抗体、反义药物组合物、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。35.如权利要求9所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。36.如权利要求17所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。37.如权利要求25所述的方法，还包括施用抗体、反义寡核苷酸、蛋白、抗原、变态反应原、化疗剂或者佐剂。全文摘要本发明涉及作为免疫刺激剂的寡核苷酸在免疫治疗应用中的治疗用途。更特别的，本发明提供一种免疫刺激性寡核苷酸，所述寡核苷酸在用于产生免疫应答或者用于治疗需要免疫刺激的患者的方法中使用。本发明的免疫刺激性寡核苷酸优选的包括新嘌呤。本发明的免疫刺激性寡核苷酸还包括至少两个寡核苷酸，所述至少两个寡核苷酸在其3′端、核苷间联结或者官能化的核碱基或者糖处与非核苷酸接头连接，其中至少一个寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸并具有易接近的5′端。文档编号C12N15/00GK101351228SQ200580052484公开日2009年1月21日申请日期2005年11月7日优先权日2005年11月7日发明者埃坎巴·R·坎迪马拉,萨德希尔·阿格雷沃尔,东郁申请人:艾德拉药物股份有限公司