抗农作物真菌多肽及其制备方法

专利名称：抗农作物真菌多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组的抗农作物真菌多肽的基因、重组质粒、多肽及其制备方法。
背景技术：
真菌感染是农作物的常见危害，比如造成稻瘟病的真菌稻梨孢每年给我国的稻米 生产造成巨大的经济损失，危害性极大。随着我国广大农业地区加速城镇化，生态 环境污染和恶化日益加剧，农作物病害发病率直线上升，农作物病害的生态防治已 成为我们必需面对和解决的重大问题。
现用抗菌农药对农作物感染真菌疗效不理想；真菌属真核细胞，它和人体细胞的 相似性使得农用抗真菌药物如三环唑类在杀伤真菌细胞的同时也杀伤人体细胞。长 期使用环唑类等化学药物诱使真菌对其产生了耐药性，而农民为抑制农作物真菌感 染往往不惜超剂量多次重复用药，这就造成农作物真菌耐药性进一步加重；同时也 造成农药在环境和农产品中的残留量越来越大，因此人类一直在致力于开发高效且 无污染的抗真菌农药。
近年来真菌基础研究取得很大的进展，已确定某些真菌如白色念珠菌信息素的氨 基酸序列，是14个氨基酸残基组成的多肽。它可以在生活介质中自由游动，具有自 动寻找同种真菌细胞胞膜上相应受体的生物学活性。因此可以利用真菌信息素的这
种自动寻找活性来诱导大肠菌素这一类细菌外毒素到达这些真菌的细胞膜上形成离 子通道来杀伤这些真菌，从而构建出一类新型生物农药。

发明内容
本发明的一个目的是提供新型的重组抗农作物真菌多肽的基因、重组质粒、多肽， 此种多肽能特异的杀灭农作物真菌细胞而不会伤害人体正常细胞，且防治效果大大 好于现用农药。本发明的再一目的是提供上述重组抗农作物真菌多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下
本发明所述抗农作物真菌多肽的基因，含有编码大肠菌素的基因和编码白色念珠 菌信息素的基因。将编码白色念珠菌信息素的基因与大肠菌素基因可操作地连接，从 而获得表达重组抗农作物真菌多肽的核苷酸序列。编码白色念珠菌信息素的基因为
序列表中SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列。大肠菌素可选自能形成离子通道的大肠
菌素E1或la或Ib或A或B或N。在本发明的一个优选实施例中，将上述白色念 珠菌信息素基因与大肠菌素Ia (SEQ ID NO.l)的羧基端基因连接而形成如序列表中 SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。在本发明的另一个实施例中，将上述白色念珠菌信 息素基因与大肠菌素la (SEQ ID NO.l)的氨基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列。
本发明所述重组质粒，是将如上所述的编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列经 双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素的羧基端或氨基端形成本发明的重组质 粒。若选用大肠菌素Ia，则将编码白色念珠菌信息素的核苷酸序列插入Ia基因的第 626位氨基酸后(羧基端)或第1位氨基酸前(氨基端)而形成本发明的诸重组质粒。 构建重组质粒的原始商用质粒pET-15b来自于Novagen公司，其中装载了大肠菌素la 和相应的Immunity蛋白基因,针对白色念珠菌信息素基因设计了数对引物,其序列见 实施例1。利用双链寡聚核苷酸点突变技术,按照Strategene公司药箱操作获得重组 质粒。
本发明的又一方面，提供本发明所述抗农作物真菌多肽的制备方法，将编码白 色念珠菌信息素的基因可操作地与大肠菌素基因连接获得编码重组抗农作物真菌多 肽基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组 抗农作物真菌多肽的工程菌细胞。用Sepharose High Performance柱分离纯化即获得
本发明所述的抗农作物真菌多肽。
本发明所述抗农作物真菌多肽可在制备治疗或预防农作物真菌感染的农药中应 用。可以通过将本发明所述的多肽添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它 成分而制成适于农作物使用的农药组合物。其机理是本发明所述多肽中可与靶真 菌细胞表面受体结合的白色念珠菌信息素诱导大肠菌素到达靶农作物真菌细胞膜附 近，然后大肠菌素通道形成结构域的疏水区段插入靶真菌细胞膜中，进而大肠菌素 通道形成结构域在靶农作物真菌细胞膜上形成离子通道，使靶农作物真菌细胞内容物 泄漏而致真菌细胞死亡，从而达到杀死农作物真菌细胞的目的。
本发明所述的抗农作物真菌多肽相较于传统抗真菌农药的优点在于，其具有特 异的靶向性，因而在使用过程中不会攻击动物细胞，其毒性和不良反应远低于传统 抗真菌农药。再由于它是在农作物真菌细胞膜上直接形成离子通道来杀伤农作物真 菌细胞，因此与传统抗真菌农药相较，农作物真菌细胞对其产生耐药性的概率要低 得多；在抗农作物真菌多肽一离子通道造成泄漏而致农作物真菌细胞死亡的这一较短时限内，农作物真菌细胞较难利用突变基因 一蛋白表达方式来修复抗农作物真菌 多肽一离子通道在真菌细胞膜上造成的几何缺损，所以农作物真菌细胞对本发明的 抗农作物真菌多肽产生耐药性的概率较低。需要特别说明的是，在本发明的实施例
中，抗农作物真菌多肽对真菌稻梨孢和黄曲霉菌等感染的农作物的治疗效果至少是 现有农药三环唑治疗效果的数千倍，证明了本发明所述抗农作物真菌多肽具有良好 的应用前景。
本发明所述方法可得到理想纯度的抗农作物真菌多肽(大于95%)并最大程 度的保存了它的生物活性，而一般CM柱分离纯化的抗农作物真菌多肽纯度较低 (约80—90%)。


图1是含有白色念珠菌信息素基因和大肠菌素Ia基因的重组质粒 pCHCEBCHl的结构示意图。
图2是含有白色念珠菌信息素基因和大肠菌素Ia基因的重组质粒 pCHCEBCH2的结构示意图。
图3是本发明所述抗农作物真菌多肽对生长于固体培养基的真菌稻梨孢 的抑制试验结果，表明抗农作物真菌多肽对真菌稻梨孢的生长抑制效应比三环 唑强数千倍；图中A三环唑5 mg/ml， B三环哇50pg/ml， C抗农作物真菌多 肽2, 5吗/ml， D抗农作物真菌多肽l， 5昭/ml。
图4是本发明所述抗农作物真菌多肽对生长于固体培养基的真菌稻梨孢 的抑制试验结果，表明抗农作物真菌多肽对真菌稻梨孢的生长抑制效应比三环 唑强数千倍；图中A三环唑5mg/ml， B三环唑500吗/ml， C三环唑50pg/ml, D抗农作物真菌多肽l， 5pg/ml。
图5为本发明所述抗农作物真菌多肽对生长于固体培养基的黄曲霉菌的抑 制试验结果，表明抗农作物真菌多肽对黄曲霉菌的生长抑制效应比三环唑强数 千倍；图中A三环唑5mg/ml， B三环唑500pg/ml， C三环唑50昭/ml， D抗 农作物真菌多肽l， 5pg/ml。
图6为本发明抗农作物真菌多肽在田间实验的情况；A农田划分用药区域 情况，其中，中间区域Control为空白对照区域，右边Ph-CA区域为本发明所 述抗农作物真菌多肽l使用区域，左边Tricyc区域是三环唑使用区域；B田间 调查情况；C喷洒农药情况。
具体实施例方式
实施例1表达抗农作物真菌多肽的质粒的构建和重组抗农作物真菌多肽 的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia和Immunity蛋白基因的pET-15b商用质粒 (质粒大小6.3kb,购自Novagen公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚 核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit, Strategene公司)将编码白色念珠菌信息 素的基因(序列表中SEQIDN0.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia基因的 1626位点后，制备出了抗农作物真菌多肽的一种重组质粒pCHCCACHl (如图 l所示)。重组质粒转染入五.co/z'BL21 (DE3)ply S工程菌里制备多肽，获得序 列表中SEQIDN0.5所述的抗农作物真菌多肽，在继后的实施例中称为"抗农 作物真菌多肽l"，其分子量为70,000。
突变程序按 Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (catalog#200518)药箱手册进行
1、 准备点突变反应物 5ul 10 x buffer
2 ul (10 ng)野生型大肠菌素Ia质粒 lul(125ng)设计的5'-3'寡聚核苷酸引物 lul(125ng)设计的3'-5'寡聚核苷酸引物 1 ul dNTP 双蒸水50 ul 1 ul pfii
(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、 进行PCR扩增，扩增条件变性95。C, 35秒，退火53°C， 70秒，延伸 68'C，17分共20个循环；
3、 加入Dpnl内切酶l ul消化母体DNA链后(37TU小时)，取l ul反应 物与HMS174感受态细胞50 ul冰孵30分钟，行热冲击42°C， 45秒,再置入冰中 2分钟；
4、 加入NZY培基0.5 ml后220rpm， 37"C摇菌1小时后，取50-100 ul反 应物铺板(LB培基加1%琼脂加50 ug/ml氨苄青霉素,37'C过夜)；
5、 18小时后挑菌,循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质
粒均可，测序确定突变成功；
6、 将质粒50 ng与制备的五.co/Z BL21 (DE3) ply工程菌感受态细胞50 ul冰 孵30分,42°C， 90秒热冲击,取50-100 ul反应物加入LB培基0.5 ml, 220 rpm， 37'C摇菌1小时后铺板(LB培基加1%琼脂加50 ug/ml氨苄青霉素)37'C孵 育,18小时后挑取菌落；
7、 大量增菌,8-16升LB培基，250rpm， 37°C，6-8小时;离心沉淀菌体，4°C, 6000g, 2b分钟，取4°C, 20 mM PBS， 0.15 MNaCl, 2mM EDTA， pH 8.0) 50-80ml 悬浮菌体，加入0.2 M PMSF 250微升后行超声破碎(4'C， 400W， 2分钟)，高速离 心沉淀破碎菌体(4'C, 75000g， 1.5小时)，取上清装入分子量15,000的透析袋于 4'C， 20 mM PBS, 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole 10升透析过夜后，将上清上样 于HisTrap柱(Amersham Biosciences),经20 mM PBS， 1 M imidazole, pH 8.0， 4 °C)洗脱后即可得到重组抗农作物真菌多肽，经20 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA， pH 8.0透析后备用。
下面列出为制备pCHCCACHl质粒的白色念珠菌信息素基因所设计的
具体双链寡聚核苷酸序列
pCHCCACHl
1、 5，-3'
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实施例2表达抗农作物真菌多肽的质粒的构建和重组抗农作物真菌多肽 的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia和Imimmity蛋白基因的pET-15b商用质粒 (质粒大小6.3kb,购自Novagen公司，上述基因由本实验室装载)，经双链寡聚 核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit, Stmtegene公司)将编码白色念珠菌信息 素的基因(序列表中SEQ ID N0.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia的SI 位点前，制备出了抗农作物真菌多肽的又一种重组质粒pCHCCACH2 (如图2 所示)。重组质粒转染入五.co/z' BL21 (DE3) ply S工程菌里制备多肽，获得序列 表中SEQIDN0.7所述的抗农作物真菌多肽，在继后的实施例中称为"抗农作 物真菌多肽2"，其分子量为70,000。
突变程序按 Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit Ccatalog#200518)药箱手册进行
1、 准备点突变反应物 5ul 10 x buffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1 ul(125ng)设计的5'-3'寡聚核苷酸引物
lul(125ng)设计的3'-5'寡聚核苷酸引物
1 ul dNTP
双蒸水50 ul
1 ul pfu
(除质粒，引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、 进行PCR扩增，扩增条件变性95'C, 35秒，退火53°C, 70秒，延伸 68°C， 17分共20个循环；
3、 加入Dpnl内切酶l ul消化母体DNA链后(37'C,1小时)，取1 ul反应 物与HMS174感受态细胞50 ul冰孵30分钟，行热冲击42°C, 45秒,再置入冰中 2分钟；
4、 加入NZY培基0.5 ml后220rpm, 37'C摇菌1小时后，取50-100 ul反 应物铺板(LB培基加1%琼脂加50 ug/ml氨苄青霉素，37"C过夜)；
5、 18小时后挑菌，循Qiagene,Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质 粒均可，测序确定突变成功；
6、 将质粒50 ng与制备的￡.co// BL21 (DE3) ply工程菌感受态细胞50 ui冰 孵30分，42°C， 90秒热冲击，取50-100 ul反应物加入LB培基0.5 ml, 220 rpm, 37'C摇菌1小时后铺板(LB培基加1%琼脂加50 ug/ml氨苄青霉素)37'C孵 育，18小时后挑取菌落；
7、 大量增菌,8-16升LB培基，250rpm, 37°C,6-8小时;离心沉淀菌体，4°C, 6000g， 20分钟，取4°C, 20 mM PBS， 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole, 2mM EDTA， pH 8.0) 50-80ml悬浮菌体，加入0.2 M PMSF 250微升后行超声破碎(4。C, 400W, 2 分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4。C, 75000g， 1.5小时)，取上清装入分子量 15,000的透析袋于4°C， 20 mM PBS， 0.15 M NaCl, 5 mM imidazole 10升透析 过夜后，将上清上样于HisTrap柱(Amersham Biosciences),经20 mM PBS， 1 M imidazole, pH 8.0， 4°C)洗脱后即可得到重组抗农作物真菌多肽，经20 mM sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 2mM EDTA， pH 8.0透析后备用。
制备pCHCCACH2质粒的白色念珠菌信息素基因的双链寡聚核苷酸序列 按实施例1的方法设计。
实施例3 抗农作物真菌多肽对农作物真菌的体外抑制试验
试验1:真菌为四川雅安市雨城区农业局植保站自田间分离的真菌稻梨孢
菌株(P_yn'cw/a"a w^ae)，取菌液5微升(108 CFU/ml级菌量)均匀涂布于沙 博氏固体培基(杭州微生物试剂厂)表面，再放置吸取50^x1各处理液的塑料 小杯于培基表面，各处理液分别为三环唑浓度5mg/ml，三环唑浓度50叱/ml， 抗农作物真菌多肽2浓度5pg/ml,抗农作物真菌多肽1浓度5pg/ml。将培基置 于35°C培养两日，结果如图3所示。结果显示，只有装三环唑浓度5mg/ml 的处理液和抗农作物真菌多肽1浓度5ng/ml的处理液小杯周围出现了完整的溶 菌环。该试验表明，真菌稻梨孢的生长只能被抗农作物真菌多肽1和大剂量的 三环唑抑制。
试验2:真菌为从中国农科院农业微生物中心购买的真菌稻梨孢菌株，菌 液5微升(1(^CFU/ml级菌量)均匀涂布于沙博氏固体培基(杭州微生物试剂 厂)表面，再放置吸取50 pl各处理液的塑料小杯于培基表面，各处理液分别 为三环唑浓度5mg/ml，三环唑浓度500ng/ml，三环唑浓度50吗/ml，抗农作物 真菌多肽1浓度5吗/ml。将培基置于35°C培养两日，结果如图4所示。结果
显示，抗农作物真菌多肽1小杯周围出现的溶菌环大于三环唑浓度5mg/ml小 杯周围的溶菌环，该试验表明，抗农作物真菌多肽1抑制真菌稻梨孢生长的效 力强过三环唑至少数千倍。
试验3:真菌为中国农科院农业微生物中心购回的黄曲霉菌菌株
Uwer/gz7/w y amy),菌液5微升(106 CFU/ml级菌量)均匀涂布于沙博氏 固体培基(杭州微生物试剂厂)表面，再放置吸取50pl各处理液的塑料小杯 于培基表面，各处理液分别为浓度5mg/ml，三环唑浓度500pg/m1,三环唑浓 度50吗/ml，抗农作物真菌多肽l浓度5pg/ml。将培基置于35°C培养两日，结 果如图5所示。结果显示，抗农作物真菌多肽l小杯周围出现的溶菌环大于三 环唑浓度5mg/ml小杯周围的溶菌环，该试验表明，抗农作物真菌多肽1抑制 黄曲霉菌生长的效力强过三环唑至少数千倍。
实施例4 抗农业真菌多肽对抗稻瘟病的田间保护试验
1、 实验材料
(1) 药物
抗农作物真菌多肽1和三环唑(对照)。
(2) 农作物及受试真菌 田间水稻及水稻植株感染的真菌稻梨孢
2、 实验方法
随机选择稻瘟病发病较重之稻田，按测试标准将稻田划分成使用抗农作物真 菌多肽1 (Ph-CA)、三环唑(Tricyc)和空白对照(Control)三个区域，将抗 农作物真菌多肽1(液体剂)、三环唑(粉剂)分别用稻田水按比例稀释成10吗/ml 抗农作物真菌多肽1和2mg/ml三环唑的使用浓度，在稻瘟病叶瘟期和茎瘟期 各喷洒一次，10—14天后按稻瘟病检测标准分别检査和记录抗农作物真菌多肽 1、三环唑和空白对照区域的叶瘟期保护率和茎瘟期损害率。稻谷成熟后在三个 区域抽样采集稻穗，称取千粒重比较防治效果。实地情况如图6所示。
3、 结果
2005年和2006年两年的田间实验结果显示，在上述使用浓度下，抗农作 物真菌多肽1和三环唑得到了较为相近的防治效果抗农作物真菌多肽1叶瘟 期保护率71 %，茎瘟期损害率0.53 %，三环唑叶瘟期保护率75 %，茎瘟期
损害率1.6% 。
抗农作物真菌多肽l的分子量(MW70,000)是三环唑分子量(MW189)的 370倍，而抗农作物真菌多肽1和三环唑的使用浓度相差200倍，因此，若按 相同药物分子数量标化后进行比较，本实施例表明，本发明所述的抗农作物真 菌多肽对抗稻瘟病感染的防治效果应是三环唑防治效果的74,000倍。
三环唑区域(Tricyc)抽样采集的稻谷千粒重为17.65 mg和20.5 mg，空 白对照区域(Control)抽样采集的稻谷千粒重为18.6 mg禾卩20.95 mg,抗农作 物真菌多肽1区域(Ph-CA)采集的稻谷千粒重为24.05 mg和24.2 mg 。按 此数据计算，抗农作物真菌多肽l区域抽样采集的稻谷千粒重比空白对照区域 抽样釆集的稻谷千粒重增加了 13.4_29.3%。
由于田间检查只统计稻瘟病造成的损伤，而稻田里的真菌病害除了稻瘟病 以外，还有其它真菌病害，如黄曲霉菌、黑曲霉菌等真菌病害。千粒重统计的 是抗农作物真菌多肽1防治所有真菌病害的综合累积。
<110〉丘小庆
<120〉抗农作物真菌多肽及其制备方法
<160> 7
<170> Patentln Version 3.2
<210> 1 <211>翻
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221 > misc—feature
<222> (1).....(1878) <223>大肠菌素Ia基因
<400> 1
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<400> 3
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ctcagtgccag犯caaBtgagca犯tgacgctcttaatgccctgttg卿1260
atatacgtaaccagctttccggcatc组c卿卿tagcg,g卿aa1320
ggcaacgaaag3CgC犯tt3卿gttcctg1380
a犯tcagttttggtgca犯agctgagcagttagccag卿gatggccggg1440
caggctaaaggg犯gaa組acgtaatgttgaagaggcatt犯aaacgteitgaa卿tac1500
cgggctgacattaacaaaaaaMtaatgcaaa卿tcgtgcagcgattgcCgC3gCCCtt1560
gagtctgtgaagctgtctgatatatcgtctgattcagtcggggactggga1620
tatgcagg3aaatttacaagtcttgctgactggatcactgagtttggt犯ggctgtccgg1680
3C卿g犯Ctggcgtcctctttttgttaaatcatagcaggcaatgccgca1740
acggctcttgtggcactggtcttcagtattcttaccgg犯gcgctttaggcattatcggg1800
tatggtttactgatggctgtcaccggtgcgctgattgatgaatcgcttgtgg咖犯gcg腳
犯t犯gttctggggtattgggtttcgtctcac犯acttcggatactttga1920
<210> 5 <211> 639 <212> PRT <213>人工序列
<223>编码抗农作物真菌多肽l氨基酸序列 <400> 5
Ser Asp Pro Val. Arg lie Thr Asn Pro Gly Ala Glu Ser Leu Gly Tyr
5 10 15
Asp Ser Asp Gly His Glu lie Met Ala Val Asp lie Tyr Val Asn Pro
20 25 30
Pro Arg Val Asp Val. Phe His Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe
35 40 45
Gly Asn Lys Thr lie Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro
50 55 60
Thr Arg Ser Asp lie Glu Lys Arg Asp Lys Glu lie' Thr Ala Tyr Lys 65 70 75 80
Asn Thr Leu Ser Ala Gin Gin Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu
85 90 95
Ala Gly Lys Arg丄eu Ser Ala Ala lie Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu
100 105 110
Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp lie
115 120 125
Thr Arg Gin Glu Phe Arg Leu Leu Gin Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Glu lie Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu 145 150 155 160
Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg lie Ser Pro Arg
165 170 175
Glu Ala Arg Ser Leu lie Glu Gin Ala Glu Lys Arg' Gin Lys Asp Ala
180 185 190
Gin Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
Arg Lys Gly lie Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly
210 215 220
Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gin Gin Ala'Arg Leu Leu Gly 225 230 235 240
Gin Gin Thr Arg Asn Asp Arg Ala lie Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu
245 250 255
Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg
260 265 270
Ala Glu Gin Gin Leu Thr Gin Gin Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr
275 280 285
lie Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser
290 295 300
lie Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr lie Lys lie Thr 305 310 315 320
Thr Ser Ala Val lie Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser
325 330 335
His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn I1& Leu Asn Asp Arg Asn Pro
340 345 350
Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys lie Tyr Asn Ala Glu 355 360 365 Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gin Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn
370 375 380
Lys lie Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu 385 390 395 400
Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gin Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala
405 410 415
Leu Uu Lys Glu Lys Glu Asn lie Arg Asn Gin Leu Ser Gly lie Asn
420 425 430
Gin Lys lie Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gin Asp Glu Leu Lys Ala Thr
435 440 Lys Asp Ala lie Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
450 455 Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gin Leu 465 470 Ala Lys Gly Lys Lys lie Arg Asn Val 485
Glu Lys Tyr Arg Ala Asp lie Asn Lys 500 505 Ala Ala lie Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp
445
Phe Leu Lys Ser Val 460
Ala Arg Glu Met Ala 475
Glu Glu Ala Leu Lys 490
Lys lie Asn Ala Lys
Ser
Gly Gin ■
Thr Tyr 舰
Asp Arg 510
lie Ser
Ser Asn 530 Thr Ser 545
Glu Asn
Asn Ala
Ser Ala
Ala Leu 610 lie Gly 625
515 Leu
Leu
Trp
Ala
Leu 595 Ilu
Phe
Asn Arg Phe Ser 535
Ala Asp Trp lie 550
Arg Pro Leu Phe 565
Thr Ala Lue Val 580
Gly lie lie Gly
Asp Glu Ser Leu 615
520 Arg
Thr
Val
Ala
Tyr 600 Val
Gly
Glu
Lys
Leu 585 Gly
Glu
Leu
Phe
Thr 570 Val
Leu
Lys
Gly Gly Glu Phe Leu Ala
Tyr
Lys 555 Thr
Ser
Met
Asn 620
Ala 540 Ala
lie
lie
Ala 605 Lys
525 Gly
Val
lie
Leu 590 Val
Phe
Lys
Arg
Ala 575 Thr
Thr
Trp
Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly 630 635
Phe
Thr 560 Gly
Gly
Gly
Gly
Lys
<210> 6 <211>1920 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1).....( 1920)
<223>编码抗农作物真菌多肽2核苷酸序列
<400> 6
gggUtcgtctcac咖cttcggatacttt
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gUgatatttatgt犯accctccacgtgix
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gtcaccggtgcgctgattgatgaatcgctt
gagcccggcaaaatgtctgaccctgtacgt60
tatgattcagatggccatga犯ttatggcc120
gatgtctttcatggtaccccgcctgcatgga 180gg咖cgagtgggttg￡Ltg￡Lttccccaacc240
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g犯gccgg^aacgcctctctgcggcgatt360
aaaacactccgtgccggaaacgcagatgcc420
ctgcaggcagagctgag卿atacggattc480
cggctgcatacag卿gccggatgctgttt540
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g編卿郷ccgctgatatgCttgCtg33660
cggttgtcag咖tggcggg720
gcccgtctgctcgggcagcagacacggaat780
ctcagttcagtgacggaatcgctt犯cacg840
cagctgacgccacgcctgac900
ccggggcgtttcattctatt960
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gtggaaaaagcg犯恤gttctggggtatt1920
<210> 7
<211> 639
<212> PRT <213〉人工序列
<223>编码抗农作物真菌多肽2氨基酸序列
<400> 7
Gly Phe Arg Leu Tyr Asn Phe Gly Tyr Phe Glu Pro Gly Lys Ser
1
Asp Pro
Ser Asp
Arg Val
Asn Lys 65
Arg
80
Thr
Gly
Thr
Arg
Arg 160 Arg
Ala
Asn
Lys
Ala 240 Gin
Ser
Glu
Val
Val 320 Ser
Ser
Ser
Leu
Lys
Leu
Gin 145 Thr
Met
Arg
Ala
Gly 225 Ala
Thr
Val
Gin
Ser 305 Val
Ala
Gly
Val
Gly
Asp
50
Thr
Asp
Ser
Arg
Lys 130 Glu
5
Arg lie 20
His Glu 35
Val Phe
lie Trp
lie Glu
Ala Gin 100 Leu Ser 115
Thr Leu
Thr Asn
lie Met
His Gly
Gly Gly 70
Lys Arg 85
Gin Lys Ala Ala Arg Ala
Phe Arg Leu Leu 150
Glu lie Ala Gly Tyr 165
Leu Phe Ala Asp Ala 180
Ser Leu lie Glu Gin 195
Asp Lys Lys Ala Ala 210
lie Leu Asp Thr Arg 230
Ala Val Leu Asp 245
Asn Asp Arg Ala 260
Glu Ser Leu Asn 275
Leu Thr Gin Gin
Leu
Arg
Thr
Gin 290 Pro
Ser
Val
Leu
Pro
Ala
Thr 55 Asn
Asp
Glu
lie
Gly 135 Gin
Asp
Asp
Ala
Gly
Val 40 Pro
Glu
Lys
Asn
Ala 120 Asn
Ala
Ala
Ser
Glu 200 Met
Asp 215
Leu Ser
Ala lie Thr
Lys 295
Glu Lys Phe Pro Gly 310
Gly Asp Pro Arg Phe 325
lie Asp Asn Arg Ala 340
Asp Tyr Lys Arg Asn 355
Gin
Ser
Ala 280 Asn
Arg
Ala
Asn
lie 360
10 Ala
25 Asp
Pro
Trp
Glu
Glu 105 Ala
Ala
Glu
Leu
Leu 185 Lys
Leu
Glu
Gin
Glu 265 Arg
Thr
Ser
Gly
Leu 345 Leu
Glu
lie
Ala
Val
lie
90
Asn
Arg
Asp
Leu
Arg 170 Arg
Arg
Ala
Leu
Ala 250 Ala
Asn
Pro
Ser
Thr 330 Asn
Asn
Ser
Tyr
Trp
Asp
75
Thr
Lys
Glu
Ala
15
Leu Gly Tyr Asp
Val Asn 45
Ser Ser 60
Asp Ser Ala Tyr Arg Thr
30 Pro
Phe
Pro
Lys
Glu 110
Lys Asp Glu
125 Ala Asp lie 140
Glu Tyr Gly
Arg 155
Leu His Thr Glu
lie Gin Glu
Ser Pro Arg 190
Lys Asp Ala
205 Tyr Glu Arg 220
Lys Asn Gly
Glu 235
Arg Leu Leu Gly
Arg Ala Asp
Asn Lys Leu 270
Leu Thr Arg
285 Gly Lys Thr 300
Asn His Ser
Thr 315
lie Lys lie Thr
Pro
Gly
Thr
Asn 95 Ala
Asn
Thr
Phe
Ser 175 Glu
Gin
Arg
Gly
Gin 255 Ser
Ala
lie
lie
Thr 335
Tyr Leu Leu Ser His 350
Asp Arg Asn Pro Val 365Val Thr Glu 370
Ala Glu Trp
385 lie Thr Ser 400
Ala Arg Thr
Leu Lys Glu
Lys lie Ala 450
Lys Asp Ala 465
Lys Tyr Gly
480 Ala Lys Gly 495
Glu Lys Tyr
Ala Ala lie
Ser Asn Leu 545
Thr Ser Leu
560 Glu Asn Trp 575
Asn Ala Ala
Ser Ala Leu
Ma Leu Ilu 625
Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys 375
Asp Lys Leu Arg Gin Arg Leu 390
Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser 405
Asn Glu Gin
420 Lys Glu Asn 435
Glu Glu Lys
lie Asn Phe Ala Lys Ala
Lys Lys lie 500
Arg Ala Asp
515 Ala Ala Ala
Lys His Ala Asn 425
lie Arg Asn Gin 440
Arg Lys Gin Asp 455
Thr Thr Glu Phe 470
Glu Gin Leu Ala 485
Arg Asn Val Glu
lie
Leu
Ala 410 Asp
Leu
Glu
Leu
Arg
Glu 505 lie
Tyr
Asp 395 Arg
Ala
Ser
Leu
Lys
Glu 490 Ala
Asn Lys Leu Leu Gly Tyr
Asn Ala Glu Val 380
Ala Arg Asn Lys
Asn Asn Leu Ser 415
Leu Asn Ala Leu 430
Gly lie Asn Gin 445
Lys Ala Thr 460
Ser Val Ser Glu 475
Met Ala Gly Gin
Leu Lys Thr Tyr 510
Ala Lys Asp Arg 525
Ser Asp lie Ser 540 Ala Gly
lie Asn Lys Lys 520
Leu Glu Ser Val 530 535
Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe
550 555 Ala Asp Trp lie Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr
565 570 Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr lie lie Ala Gly 580 585 590
Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser lie Leu Thr Gly
595 600 605
Gly lie lie Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly 610 615 620
Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly lie 630 63权利要求
1、编码抗农作物真菌多肽的基因，其特征在所述基因由编码白色念珠菌信息素的基因与编码大肠菌素的基因连接而成，编码大肠菌素的基因选自能形成离子通道的大肠菌素E1或Ia或Ib或A或B或N。
2、 根据权利要求1所述的抗农作物真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中 SEQIDN0.4所述的核苷酸序列。
3、 根据权利要求1所述的抗农作物真菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中 SEQ ID N0.6所述的核苷酸序列。
4、 抗农作物真菌多肽的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1或2或3所述的 基因。
5、 抗农作物真菌多肽，其特征在于它由权利要求4所述的重组质粒表达而成。
6、 根据权利要求5所述的抗农作物真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID N0.5所述的氨基酸序列，其分子量为70,000。
7、 根据权利要求5所述的抗农作物真菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQID N0.7所述的氨基酸序列，其分子量为70，000。
8、 权利要求5或6或7所述抗农作物真菌多肽在制备治疗或预防农作物真菌感染 的农药中的应用。
9、 权利要求5或6或7所述抗农作物真菌多肽的制备方法，其特征在于包括以下 步骤将白色念珠菌信息素的基因与编码大肠菌素E1或Ia或Ib或A或B或N的基因 连接获得编码重组抗农作物真菌多肽的基因，将获得的基因导入到表达系统中进行表 达，分离表达的多肽而获得抗农作物真菌多肽。
全文摘要
本发明公开了一种新型抗农作物真菌多肽及其制备方法，该重组抗农作物真菌多肽由编码白色念珠菌信息素的基因与编码大肠菌素的基因连接而成。本发明所述新型抗农作物真菌多肽相较于现用抗农作物真菌药物的优点在于，其直接在真菌细胞膜上形成离子通道来杀伤真菌，因此杀伤效率强于现用抗农作物真菌药物数千倍；由于真菌难以通过突变-表达方式来修补该多肽在其胞膜上造成的几何损伤，因此该多肽不会诱导真菌产生传统的耐药性；由于该多肽是一种生物制剂，对真菌是靶向性杀伤，因此它无现用抗农作物真菌化学药物的毒副作用。
文档编号C12N15/31GK101200727SQ20071005092
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者丘小庆 申请人:丘小庆