专利名称：与肝细胞癌发生相关的1p36.22区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝细胞癌Ofepatocellular carcinoma, HCC)的人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法、试剂盒及其应用。具体地，本发明涉及与HBV相关HCC发生风险相关的易感基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的rsl7401966基因型的检测方法；本发明进一步涉及上述易感基因组区域基因型的检测试剂盒；另外，本发明还涉及上述易感基因组区域、相关检测方法和检测试剂盒在HCC的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
HCC是最常见的癌症之一，居全球癌症死亡原因的第五位。HCC很少能够在早期得到诊断，并且通常在确诊后的几个月内死亡。据估计，全世界每年有超过50万新发HCC病例 1O HCC的发病率与致病因素在不同地区存在显著差别2’3。尽管在欧洲、北美和日本，与慢性丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)感染相关的HCC的发病率越来越高，但在全球范围内慢性乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)感染仍是HCC发生的最重要的原因。尤其是在中国和非洲等高度流行的地区，慢性HBV感染导致至少80%的HCC病例2。然而，只有一小部分慢性HBV携带者在其一生中发生HCC4。和其他常见的癌症一样，慢性HBV携带者发生HCC的风险在不同个体之间存在差异，这种差异也是由遗传和环境因素之间复杂的相互作用而导致的5。针对HBV相关的HCC进行的分离分析(Segregation analysis)提示了这一恶性肿瘤的多基因遗传背景6’7。与连锁研究策略相比，基于候选基因的病例_对照关联研究对鉴定新的易感基因位点具有更大的效能。这种研究已经鉴定了与HBV相关HCC 的多个易感基因(如ESR1)及遗传变异位点8’9。但是，总体而言，鉴定与HCC的发生和发展相关的易感基因的进展仍然十分缓慢。1ρ36区域发生杂合缺失(Loss of heterozygosity, L0H)的现象在人类恶性肿瘤包括HCC中广泛存在12_14。值得关注的是，新近一项研究提示1ρ36. 21-36. 32发生的LOH 可能是肝癌致病机制中的早期事件，提示在此区域存在潜在的抑癌基因14。特别地，在包含 UBE4B-KIF1B-PGD 的 1ρ36. 22 区域，发明人运用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)的方法检测了其蛋白表达。结果发现与配对HCC组织相比，癌旁非肿瘤肝组织中总KIFlB(包括KIFlB α和KIFlBP )、KIFlBa和P⑶的表达水平更高(η = 20例，Wilcox P值分别为 0. 0020,0. 046和0. 0039)。而且，在癌旁非肿瘤肝组织中，与rsl7401966AA携带者相比，G等位携带者总KIFlB表达水平更高(P = 0.0084)。此外，发明人在67例无关个体来源的EBV 转化外周血淋巴细胞中，采用实时定量逆转录PCR的方法检测KIFlBii的mRNA表达水平。 结果清楚表明在G等位携带者中，KIFlBii转录水平显著增加(P = 3.7X10_4)。总的说来， 这些结果与早先报道的KIFlB β作为潜在的抑癌基因是一致的，且包含UBE4B-KIF1B-P⑶ 的1ρ36. 22区域可能在HBV相关HCC的发病机制中发挥作用。但是，目前尚没有基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性与HBV相关HCC 发生的易感性之间存在相关性的研究报道。
发明内容
发明人克服上述现有技术的不足和缺陷，提供一种HBV相关HCC的易感基因、易感多态性位点、多态性位点的检测方法、检测试剂盒及其应用。通过基于病例对照人群和核心家系的大样本遗传关联研究以及大量的实验室实验判明，与在基因组1ρ36. 22区域(UBE4B-KIF1B-P⑶)携带rsl7401966G等位的慢性HBV 携带者相比，携带rsl7401966A等位的慢性HBV携带者更易罹患HCC ；与携带rsl7401966GG 基因型的慢性HBV携带者相比，携带AA或AG基因型的慢性HBV携带者更易罹患HCC。因此本发明鉴定了一个与HBV相关HCC发生关联的新的易感基因组区域、易感等位和易感基因型，该易感基因组区域1ρ36. 22包括但不限于UBE4B、KIF1B、P⑶等易感基因。本发明还提供了一种检测与HBV相关HCC发生关联的易感多态性位点rsl7401966 的方法，该方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。本发明还提供了一种通过检测rsl7401966多态性位点的基因型来判断个体对 HCC是否易感的方法。本发明还提供了用于检测多态性位点rsl7401966的引物和探针。本发明进一步提供了用于检测与HBV相关HCC发生风险关联的rsl7401966的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制HCC的应用。一、如上所述，本发明提供了检测与HCC易感性关联的1ρ36. 22区域 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性位点rsl7401966的方法，该方法包括但不限于SNPstream分型和TaqMan分型等方法。1、SNPstream分型，包括如下步骤，其特征在于对rsl7401966进行基因型判别1)对包含多态性位点rsl7401966的基因组区域，根据碱基互补的原则设计特异性的扩增引物对和延伸引物；2)用1)中的特异性引物对进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；3)以1)中的特异性延伸引物在每个SNP位点进行延伸反应，生成特异性的延伸产物；4)延伸产物与检测板杂交，扫描成像并生成基因型。2、TaqMan分型，包括如下步骤，其特征在于对rsl7401966进行基因型判别1)对包含多态性位点rsl7401966的基因组区域，根据碱基互补的原则设计特异性的扩增引物对和探针；2)用1)中的特异性引物对进行PCR扩增，根据荧光探针所产生信号的不同即可得知rsl7401966的基因型。二、本发明还提供了与HBV相关HCC发生关联的易感等位和易感基因型，即 1ρ36. 22区域(UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性位点rsl7401966A等位为HCC的易感等位，AA或 AG为HCC的易感基因型。并提供了通过检测rsl7401966来判定人群或个体对HCC发生的易感性的方法。该方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。其特征在于1、针对样本基因组DNA，采用SNPstream分型或TaqMan分型的方法判定 rsl7401966的基因型；2、当某一个体的rsl7401966表现为AG基因型或AA基因型(即携带1个或2个A等位)，则表明该个体患HCC的可能性更高。三、本发明还提供了检测多态性位点rsl7401966基因型的特异性引物和探针的序列，其特征在于能够特异性地扩增出包含rsl7401966的DNA片段，并准确鉴定rsl7401966的基因型。正反向引物序列根据序列互补的原则在待检测多态性位点 (rsl7401966)的上下游设计，一般而言，引物长度为20bp左右，所扩增的目的片段(包含 rsl7401966)的长度为IOObp左右。设计软件包括但不限于autoprimer或primer3等。优选地，引物和探针序列为SNPstream 分型正向引物5‘ -CTTCAGCCTCATTTTTTTTTTATAC-3 ‘反向引物5,-TTCCCTGCTTTGAAAATTTG-3 ‘延伸引物5'-GTGATTCTGTACGTGTCGCCAAACACATAGTGCCTCTATGAGTCC-3'TaqMan 分型正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，
反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，MGB 探针 1:5' (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘MGB 探针 2:5' (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘四、本发明进一步提供了检测与HBV相关HCC发生风险关联的易感基因组区域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性位点rsl7401966的试剂盒，其特征在于装有一个或多个容器，容器内装有用以检测多态性位点rsl7401966基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。以基于TaqMan分型方法检测rsl7401966的试剂盒为例，在DNA的PCR 扩增方法实施中，检测样品的多态性位点rsl7401966的基因型的试剂盒，含有PCR的引物对和探针(正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探针 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探针 2 5 ‘ (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘)，以及用于 PCR 反应的包含 dNTPs 和 DNA 聚合酶在内的预混缓冲液等。使用方法说明如下对样品基因组DNA，用本发明提供的引物和探针，按照如下反应体系和条件进行 PCR扩增5μ 1反应体系为IOng/μ 1基因组DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各0. 25 μ 1， ΙΟμΜ 的探针各 0. 125μ 1，以及 2. 5μ 1 2Χ 预混缓冲液(Applied Biosystems TaqMan Genotyping MasterMix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 条件为50°C 2 分钟；95°C 10 分钟；950C 15秒和60°C 1分钟,共计40循环。PCR反应在Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR仪上完成，并即时得到基因型。具体见实施例。本领域技术人员已知，以上所列分型方法及试剂盒的组分仅是示意性的，可包括发明内容1-3中任一项提到芯片、杂交板、引物、探针、dNTPs、各种酶制剂及各种缓冲液及其它溶液的一种或多种。 五、本发明还提供了与HBV相关HCC发生风险关联的易感基因组区域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多态性位点rsl7401966基因型的检测方法及其在HBV相关HCC人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了 rsl7401966基因型与HBV相关HCC发生的易感性存在关联，因此，在HBV相关HCC人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象开展rsl7401966基因型的检测，以判断该对象是否携带有HBV相关HCC易感基因型rsl7401966AG或AA (即携带1个或2个A等位，表现为对HBV相关HCC具有更高的易感性)。对具有基因型rsl7401966AG或AA的个体，则可对之进行科学的干预，例如建议及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群的HBV相关HCC的发生风险。
图1 :rsl7401966在合并所有六个人群后进行荟萃分析得到的森林图O^orest plot)。图中显示了每个人群的OR值(蓝色方块所处位置)和95% CI (蓝色水平线)。垂直虚线表示六个人群中的最终OR值。上面6行分别代表六个人群的数据，其下方的蓝色菱形代表合并效应值。每个蓝色方块的面积与该人群在荟萃分析中的权重成正比。荟萃分析指出联合 P 值为 1. 7 X IO"18,联合 OR 值为 0. 61 (95% CI = 0. 55-0. 67))。P异质性=0. 60。图2 :rsl7401966基因型与诊断年龄之间的关联分析。竖线表示标准差。风险基因型携带者的HCC诊断年龄提前了 1. 1岁(AA vs. AG+GG，P = O. 020，t检验)。图3 :1ρ36. 22区域的局部关联图。rsl7401966及其周围SNP对应的横坐标是其所在的基因组位置(NCBI组装版本36)，纵坐标是关联P值(-IogltlP)。rsl7401966在荟萃分析中的P值以蓝色菱形显示，在GWAS阶段的P值以大的红色菱形表示。其它位点的颜色代表其与rs17401966之间的LD程度红色表示r2 ^ 0. 8，橙色表示0. 5 < r2 < 0. 8，黄色表示0. 2 < r2 < 0. 5，白色表示r2 < 0. 2。浅蓝色线表示估计的重组率(来自HapMap计划)。从 Santa Cruz GenomeBrowser (http //Renome. ucsc. edu/)基因组浏览器中得出基因的位置(NCBI组装版本36)。rsl7401966位于KIFlB基因的内含子M。图的下部显示了 rsl7401966(红色箭头所示)前后共约1Mb范围内的LD结构，以广西病例对照人群共707 个个体的基因型数据计算。SNP之间的LD值以r2估计，同时红色的程度表示r2值的大小， 最深的红色表示r2 = 1。重组图和LD结构都清晰显示出重组热点的边界。rsl7401966定位于一个约2441Λ范围的LD区域，该区域包括了 KIF1B、P⑶和UBE4B基因的3，端。
具体实施例方式实施例1该实施例设计并合成了一套扩增引物对和一条延伸引物，并且在这些引物的基础上，设计了一种检测与HCC发生风险关联的易感基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性位点rsl7401966基因型的方法。1、基因组DNA的提取采取本领域酚/氯仿法提取外周血白细胞的基因组DNA。1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml (尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混勻，冰中放置5分钟，4°C 2000rpm离心 20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0. 1 % Triton-XlOO (体积同上)，轻柔混勻沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入裂解液(50Mm Tris-Cl-IOmM EDTA, pH8. 0)，彻底打碎沉淀，然后加入10% SDS至终浓度为0. 5%，混勻；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200 μ g/ml，混勻，55°C 3小时或37°C过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入等体积平衡酚，倒转混勻，4000rpm离心10分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)转移上层水相，重复酚抽提一次；8)转移上层水相，加入等体积的氯仿异戊醇04 1)，倒转混勻，4000rpm离心 10分钟；9)转移上层水相，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5. 2)和2. 5倍体积预冷的无水乙醇混勻；10)置液氮冷冻10分钟或-20°C 60分钟后，4000rpm离心10分钟；11)以70%乙醇洗涤沉淀1 2次，吹干或真空抽干；12)以 0.5ml TE (IOmM Tris-Cl-EDTA，pH8. 0)或蒸馏水溶解 DNA 沉淀，电泳检测 DNA片段大小，或测^0Λ80ηπι OD比值。2、引物设计、合成及准备1)使用 autoprimer 软件(http:// www. autoprimer. com/, Beckman 公司提供)对 rsl7401966进行12重引物设计。因此，除了 rsl7401966之外，最多还可加入其它11个SNP 位点并同时进行分型检测。所有引物序列由上海英骏公司合成，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG^纯化。2)利用SNPstream分型的PCR条件对每对PCR引物进行测试，确保引物特异性。 PCR程序为95°C 15分钟预变性，接下来的45个循环中包括三步，即94°C 30秒、55°C 20秒和72°C 1分钟，PCR结束后保持在4°C待用。电泳检测PCR扩增的效率和产物的特异性(产物的特异性由测序结果最终确定)。3)配制PCR引物池(共12X2个)，每条引物终浓度为10 μ M。4)配制延伸引物池(共12个)，每条延伸引物终浓度为10 μ Μ。3、多重PCR反应1)准备12重PCR反应混合液。按照一个384孔板的用量，各组分体积如下PCR 引物池 11. 25μ l，dNTP 67. 50 μ 1，10XPCR Buffer II 225. 00 μ 1,MgCl2 (25mM) 450. 00 μ 1, AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/ μ 1) 45. 00 μ 1, ddH20 551. 25 μ 1，共计 1350. 00 μ 1。2)向384孔板的每个孔内加入3 μ 1配好的PCR反应混合液，再将稀释好的IOng/ μ 1基因组DNA加入到对应的孔内，每孔加2 μ 1。3) 200g离心后，在PCR仪上进行扩增，PCR程序为95°C 15分钟预变性，接下来的 45个循环中包括三步，即94°C 30秒、55 °C 20秒和72 °C 1分钟，PCR结束后保持在4°C待用。3、多重PCR产物的纯化1)配制Clean-up混合液。按照一个384孔板的用量，各组分体积如下Exo I (20U/ μ 1)45 μ 1，SAP(lU/y 1)448 μ 1，10XSAP Buffer 135 μ 1，ddH20 667 μ 1，共计 1350 μ 1。2)将PCR反应后的384孔板200g离心，再加入配制好的Clean-up混合液，每孔3μ1。封膜并以200g离心。3)在PCR仪上进行纯化过程，程序为37°C 30分钟，96°C 10分钟，保持在4°C待用。4、单碱基延伸1)配制引物延伸反应混合液。按照一个384孔板的用量，各组分体积如下 ExtensionDilution Buffer 1692. 5 μ 1, Extension Primer Mix 13. 5 μ 1, 20XExtension Mix 90. O μ 1, ddH20 1336. 5 μ 1，DNA Polymerase 9. 4 μ 1，共计 3150 μ 1。2)将纯化后的PCR产物200g离心，向每孔中加入7 μ 1配制好的引物延伸反应混合物。封膜并以200g离心。3)在PCR仪上进行延伸反应。PCR程序为96°C 3分钟，接下来的46个循环中包括两步，即94°C 20秒和40°C 11秒，PCR结束后保持在4°C待用。5、杂交反应1)配制 12 重 SNPware 杂交板清洗液 I。用 ddH20 将 20XSNPware Wash Buffer I 稀释到终浓度为IX的杂交板清洗液I。2)清洗SNPware杂交板3次。每次吸取10 μ 1杂交板清洗液I，加入到杂交板上的每个孔中。将SNPware杂交板翻过来放在无尘纸上，放在离心机的托盘内进行离心，使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。离心速度为200g，时间为1分钟。按照上述步骤共重复清洗3次。注意离心力不可超过200g，以免损坏杂交板。3)配制杂交混合液。按照一个384孔板的用量，各组分体积如下=Hybridization Solution3402 μ 1, Hybridization Additive 198 μ l，#if 3600 μ 1。4)向PCR板每孔中加入8 μ 1上述杂交混合液，在离心机上稍微离心使其混合均勻。取出15 μ 1加入到SNPware杂交板上对应的孔内，并用枪头反复吹打使之混勻。5)将加入混合液的SNPware杂交板放入一个密封的盒子中，盒内预先放几张湿润的纸巾，保证孵育过程中盒内湿度，防止杂交板蒸干。于42°C温箱孵育浊士 15min。6)配制 SNPware 杂交板清洗液 II。用 ddH20 将 64XSNPware Wash Buffer II 稀释到终浓度为IX的杂交板清洗液II。7)杂交完成后，吸取10μ 1杂交板清洗液II，加入到杂交板上的每个孔中，清洗杂交后的SNPware杂交板。8)将SNPware杂交板翻过来放在无尘纸上，一起放在离心机的托盘内进行离心， 使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。离心速度为200g，时间为1分钟。按照上述步骤共重复清洗3次。注意离心力不可超过200g，以免损坏杂交板。6、基因型判读1)清洗完毕后，用无尘纸蘸取少量无水甲醇擦拭杂交板背面玻片，使其清晰无痕迹，然后在扫描仪上扫描原始数据。2)使用SNPstream V2. 2软件包对原始数据进行分析得到rsl7401966和其它11 个SNP位点在每个个体中的基因型。实施例2该实施例设计并合成了一套扩增引物对和一对探针，并且在这些引物和探针的基础上，设计了一种检测与HCC发生风险关联的易感基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多态性位点rsl7401966基因型的方法。1、基因组DNA的提取同实施例1。2、引物和探针合成根据rsl7401966所在基因组区域设计引物对和探针序列，其中正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探针 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探针 2 5' (HEX)-TATGAGTCCGTATTGAGT-3‘。所有引物和探针由商业公司(如上海基康公司等)合成，以ddH20将引物稀释成20 μ Μ,将探针稀释成10 μ Μ。注意探针需_20°C避光保存。3、PCR 反应对样品基因组DNA，用本发明提供的引物对和探针，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增。5μ 1反应体系为dOng/y 1基因组DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各 0.25 μ 1，10 μ M 的探针各 0. 125 μ 1，以及 2. 5 μ 1 2Χ 预混缓冲液(Applied Biosystems TaqManGenotyping Master Mix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 条件为50°C 2 分钟； 950C 10 分钟；95°C 15 秒和 60°C 1 分钟，共计 40 循环。PCR 反应在 Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR仪上完成。4、数据分析和基因型判读1)在Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR仪上的SDS软件中，选择 Analysis — Analysis Settings。2)在Marker下拉菜单中选择Marker。3)在 Analysis kttings 对话框中，选择自动分型 Auto Caller，输入 Quality value或者接受默认设置，点OK接受分析参数，并退出窗口。4)菜单Analysis — Analyze, SDS软件即开始分析数据，并在Results页面显示
计算结果。5)切换到Result页面的Allelic discrimination子页面，在Marker下拉菜单中选择Marker，在下面界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔，即在中间的图谱上显示信号点的分布情况。扩增曲线的纵坐标代表FAM的相对荧光信号强度，横坐标代表HEX的相对荧光信号强度。6)正常的基因型信号聚为4类，靠近原点处为空白对照NTC;靠近X轴的是HEX信号(GG纯合子)；靠近Y轴的是FAM信号(AA纯合子)；靠近对角线位置的样品既有FAM信号也有HEX信号(AG杂合子)。7)从File菜单中选择Export，输出基因型数据。实施例3该实施例用实施例1和2建立起来的方法，对六个人群的rsl7401966基因型进行了分析。1、试验对象本研究包括五个独立病例对照人群(共计2，317例病例和1，790例对照)以及一个核心家系人群(159个核心家系)。所有入选者均为中国成年人，其中广西病例对照人群、 广西家系和广东病例对照人群从中国南方招募，上海病例对照人群和江苏病例对照人群从中国东部招募，北京病例对照人群从中国北部招募。HCC病例均为慢性HBV携带者、新近确诊、未经放化疗治且不合并其它肿瘤。HCC的诊断标准包括组织活检阳性；血清甲胎蛋白水平彡400ng/ml，合并一项影像学诊断阳性。对照也均为慢性HBV携带者，其入选标准为 无癌症病史，且性别与年龄(士5岁)分布与肝癌病例匹配。所有病例和对照均无直系亲属关系。HBV携带者HBsAg和HBcAb均为阳性并持续6个月以上。吸烟者的定义为研究对象在确诊或收集资料之前至少吸烟一年以上。吸烟资料包括吸烟史、每天吸烟量、吸烟起始年龄和戒烟年龄等。吸烟者以“包-年”数(pack-year) 为累计吸烟剂量指标，计算公式为(每日吸烟支数+20支)X吸烟年数。轻度与重度吸烟的界定标准为对照人群吸烟者中“包-年”的均值，在本研究中“包-年” ^ 19为轻度吸烟，> 19为重度吸烟。饮酒者的定义为每周饮酒一次或以上，且持续6个月或以上。所有入选者均为HCV、HDV、HIV阴性，且无其他类型的肝病。本研究由北京放射与辐射医学研究所医学伦理委员会批准执行。每名参与者均签署知情同意书，并通过结构化调查问卷提供社会人口学和临床信息。下面列出的是六个人群的详细情况广西病例对照人群发明人此前于2002年7月至2004年10月自广西肿瘤医院 (中国南宁)招募了 248例罹患HCC的慢性HBV携带者和239例未患HCC的慢性HBV携带
-W 9 百 ο在本发明中，发明人于2005年5月至2008年1月从该医院又招募了 112例病例。 所有360例病例均为无关中国成年人，居住在广西扶绥及其周边地区，该地区是中国南部一个众所周知的HCC高发区。病例的回应率(response rate)为91%。发明人另外招募了 116例未患HCC的慢性HBV携带者作为对照，这些对照与病例之间无直系亲属关系。对照是于同期在同一地区开展的社区肿瘤早期筛查计划中随机挑选的。对照的回应率为90%。 在GWAS阶段，经过严格的质量控制，有7例病例和1例对照被排除。因此，最终的广西病例对照人群为348例病例和359例对照。北京病例对照人群这个病例对照人群共包括276例罹患HCC的慢性HBV携带者和266例未患HCC的慢性HBV携带者。所有病例均于2003年3月至2009年2月期间在中国医学科学院肿瘤防治研究所肿瘤医院招募，这是中国北部的一个三级转诊中心(中国北京)。HCC患者均为居住于位于中国北部的北京市及其周边省份的无关中国成年人，回应率为88%。于同期在同一地区开展的6，450名个体的社区营养调查中，招募非肿瘤个体作为对照1CI。基于体检及血清HBV标志物检查，以及与病例在年龄和性别上的匹配情况来挑选对照，其回应率为83%。广东病例对照人群这个病例对照人群共包括751例罹患HCC的慢性HBV携带者和509例未患HCC的慢性HBV携带者，于2003年8月至2007年11月在位于中国南部广东省广州市的中山大学肿瘤防治中心招募。病例的回应率为91%。对照为无关献血者，回应率为94%。所有病例对照均为无关中国汉族成年人，并自称是居住于广州及其周边地区的广东人。上海病例对照人群这个病例对照人群于2003年2月至2008年7月在位于中国东部上海市的东方肝胆外科医院招募。入选和排除标准此前已有报道“。在本研究中，只有慢性HBV携带者入选。此外，由于DNA耗尽，只有部分病例和对照入选。因此，这个病例对照人群总共包括4 例HCC患者和440例对照。所有入选者均为居住于中国东部上海市及其周边地区的无关中国人。病例和对照的回应率分别为86%和92%。江苏病例对照人群自2005年8月至2009年5月，在位于江苏省的启东市肝病研究所、南京医科大学第一附属医院、海门市疾病预防控制中心、南通市肿瘤医院共招募507 例病例。江苏省的启东市、海门市和南通市位置接近，地处中国东部，是另外一处众所周知的HCC高发区。回应率为89%。215例对照是于同期在江苏省开展的社区非传染病筛查项目中随机挑选的，回应率为92 %。广西核心家系人群自2005年7月至2008年2月在广西肿瘤医院(中国南宁) 招募159个核心家系。HBV相关的HCC患者作为先证者，其入选标准与前述广西人群是一样的。先证者的回应率为95%。先证者的诊断年龄只有35. 9岁，这是因为TDT分析要求其父母均在世。广西核心家系人群中的先证者与广西病例对照人群中的病例之间无重复。六个人群的社会人口学信息如表1所示。2、rsl7401966基因型的确定在广西病例对照人群中(GWAS阶段)，rsl7401966的基因型频率分布如表2所示。 与A等位相比，G等位与HCC发生风险降低有关。以加性模式为例，统计结果显示每增加一个G等位的患病风险降低0. 53倍[95%置信区间(95% Cl) = 0. 41-0. 70 ；P = 5. 8X IO"6] (表2)；也即A等位为HCC的易感等位，每增加一个A等位的患病风险增加1. 89倍。采用实施例1中的方法，在北京病例对照人群中(重复验证阶段1)对rsl7401966 进行了分型，以验证其在广西病例对照人群中的关联结果。以加性模式为例，统计结果显示每增加一个G等位的患病风险降低0.49倍[95% CI = 0.37-0.67 ；P = 3. 5X 10_6](表2)； 也即A等位为HCC的易感等位，每增加一个A等位的患病风险增加2. 04倍。进一步采用实施例2中的方法，在另外三个病例对照人群中(重复验证阶段2)验证rsl7401966的关联结果。以加性模式为例，统计结果显示在三个病例对照人群中，每增加一个G等位的患病风险分别降低0. 65倍[95% CI = 0. 54-0. 79 ；P = 1. 4X IO"5](广东病例对照人群)、0· 66倍[95% CI = 0. 52-0. 83 ；P = 4. 4X 10_4](上海病例对照人群)和 0. 58倍[95% CI = 0. 45-0. 75 ；P = 3. 9 X IO"5](江苏病例对照人群)；也即在三个病例对照人群中A等位均为HCC的易感等位，每增加一个A等位的患病风险分别增加1. 54、1. 52 和1. 72倍。接下来，发明人采用实施例2中的方法在广西核心家系人群(重复验证阶段3)中对rsl7401966进行了分型。同样的，传递/不平衡检验(Transmission/disequilibrium test, TDT)发现rsl7401966与HCC存在显著关联(x2 = 5. 08,P = 0. 024)，关联方向与前述基于人群的结果一致(表3)。3、深入分析rsl7401966基因型与HCC发生的易感性之间的相关性将两个重复验证阶段共四个病例对照人群进行合并分析，rsl7401966与HCC存在显著的关联，且达到了全基因组关联所需的显著性水平(P = 5. 1X10_15)。进一步与GWAS 阶段数据合并分析，在总共2，310例病例和1，789例对照中，关联P值达到了 3. 4X 10_19。 将所有五个病例对照人群和一个核心家系人群合并进行荟萃分析(meta-analysis)，结果表明联合P值达到了 1.7X10_18，联合比值比(odds ratio，OR)为0.61(图1)。此外，在各人群之间不存在显著的异质性(异质性检验P值为0. 60)。发明人详细评估了 rsl7401966影响HCC发生风险的遗传模式。在所有病例对照人群中，rsl7401966的基因型频率都是比较类似的。在合并人群中，rsl7401966的次要等位G以剂量效应的方式在HCC发生中起保护作用(OR杂合子=0. 64,95% CI = 0. 56-0. 73 ；OR 纯合子=0. 35,95% CI = 0. 26-0. 47 ；Piii5 = 3·4Χ10_19)。基于发明人的数据，加性模型和显性模型都比隐性模型更加适用，但是加性模型更加简约。发明人进一步按照性别和年龄分层来检测rsl7401966对HCC发生风险的影响。在合并后的病例对照人群中发现，遗传效应在男性中更加明显(异质性检验P值为0. 027 ；表 4)。按照年龄分层则没有发现遗传效应存在任何显著性差异(异质性检验P值为0. 13)，但是，仅基于病例(case-only)的分析结果表明，与AA纯合子携带者相比，保护性G等位的携带者的 HCC 诊断年龄(age at diagnosis)晚 1. 1 岁(P = 0. 020 ；图 2)。4、解析rsl7401966所在区域(1ρ36. 22)的HCC易感基因新鉴定的HCC发生相关的易感基因组区域1ρ36. 22至少包括UBE4B、KIF1B、P⑶等基因(图3)。KIFlB基因编码驱动蛋白超家族成员，参与细胞器和泡囊的转运15。KIFlB基因有多个可变剪接体，目前在多种恶性肿瘤中检测到KIFlB β的种系性(germline)和体细胞性 (somatic)失活突变16_18。此外，近期两项独立的研究均发现在神经母细胞瘤中1ρ36.2区域的KIFlBii是潜在的肿瘤抑制基因，作用于EglN3脯氨酸羟化酶的下游通路并诱导凋亡
19,20
O泛素通路调控细胞增殖、凋亡、细胞周期和DNA修复等多种细胞功能，该调控网络的失调涉及包括HCC在内的多种肿瘤21’22。UBE4B编码泛素连接因子E4，参与多泛素链组装23。尽管目前关于UBE4B参与HCC的证据很少，UBE4B仍然很有可能是HCC的候选易感基因。在最终死亡的神经母细胞瘤中发现，UBE4B基因的剪接位置(splice site)发生突变 24O与早期/预后良好的神经母细胞瘤患者相比，晚期/预后不良的神经母细胞瘤患者体内 UBE4B的表达显著降低M。此外，UBE4B在p63介导的顺钼诱导所致凋亡的调控中发挥重要作用M。P⑶基因参与戊糖磷酸代谢，尽管P⑶参与HCC发生的生物学可能性尚有待深入阐明，PGD蛋白酶的失调在多种恶性肿瘤中经常出现26’27，提示其功能的重要性。总之，以往的研究以及发明人的关联研究和功能研究均提示，rsl7401966所在区域(1ρ36. 22)的HCC易感基因包括UBE4B、KIF1B、PGD等基因。因此，用本发明的方法解析了基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的 rsl7401966基因型与HCC发生的易感性之间的相关性。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本申请权利书所限定的范围之内。这些改动或修改包括但不限于1、HCC发生相关的多态性位点本发明鉴定的HCC发生的易感区域1ρ36. 22至少包括一个跨度约2441Λ的较大基因组片段(包含rsl7401966)，如图3所示。该区域中有多个多态性位点与rsl7401966呈
12较强的LD状态，它们同样能够指示HCC的发生风险。因此，对这些多态性位点的检测同样落在本申请权利书所限定的范围之内。2、HCC发生相关的易感基因本发明鉴定的HCC发生的易感区域位于1ρ36. 22，该区域由紧密相连的多个较小区域组成，如图3所示。其中一个区域包括UBE4B、KIF1B和P⑶等易感基因。但是，本领域技术人员已知，位于1ρ36. 22的其它区域的基因也有可能是与HCC发生相关的易感基因，对这些基因的检测同样落在本申请权利书所限定的范围之内。3、检测rsl7401966或与之呈较强LD的其它多态性位点的方法本发明提供了检测与HCC发生的易感性关联的1ρ36. 22区域(UBE4B-KIF1B-P⑶) 多态性位点rsl7401966的两种方法，包括SNPstream分型和TaqMan分型等方法。但是，本领域技术人员已知，以上的分型方法仅是示意性的，用于检测rsl7401966或与之呈较强LD 的其它多态性位点的方法可以是任何一种分型方法或其改进，可以使用本发明中列出的引物和探针或针对这些位点的其它任何引物和探针。这些分型的方法及所用引物和探针同样落在本申请权利书所限定的范围之内。
权利要求
1.一种与HCC发生易感性关联的基因组区域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多态性位点rsl7401966的检测试剂盒，包括序列1 7所示扩增和延伸用基因特异性引物、探针和 dNTP,以及用于PCR反应、纯化反应、延伸反应和杂交反应的各种酶制剂及缓冲液的一种或多种。
2.一种检测1ρ36. 22区域多态性位点rsl7401966的基因型的特异性扩增引物对和延伸引物，其特征为1)对包含多态性位点rsl7401966的基因组区域，根据碱基互补的原则设计特异性的扩增引物对和延伸引物；2)所设计的特异性引物序列为正向引物(见序列表中序列1)，反向引物(见序列表中序列2)，延伸引物(见序列表中序列3)。
3.一种检测1ρ36. 22区域多态性位点rsl7401966的基因型的特异性扩增引物对和探针，其特征为1)对包含多态性位点rsl7401966的基因组区域，根据碱基互补的原则设计特异性的扩增引物对和探针；2)所设计的特异性引物和探针序列为正向引物(见序列表中序列4)，反向引物(见序列表中序列5)，MGB探针1 (见序列表中序列6)，MGB探针2 (见序列表中序列7)。
4.权利要求2或3中所述的引物对、延伸引物或探针在制备检测试剂盒中的应用，其特征为该检测试剂盒可检测与HCC发生易感性关联的基因组区域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-PGD)的多态性位点 rsl7401966 的基因型。
全文摘要
本发明涉及与HBV相关肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患病风险相关的易感基因组区域1p36.22的多态性位点rs17401966的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法为SNPstream分型和TaqMan分型，本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将1p36.22区域的多态性位点rs17401966与HBV相关HCC的患病风险联系起来，确定了1p36.22是HBV相关HCC的一个新的易感基因区域，为HBV相关HCC的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。
文档编号C12Q1/68GK102277414SQ20101019696
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者周钢桥, 张红星, 翟芸, 贺福初 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所