专利名称：一种泥蚶线粒体coi基因扩增引物的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种泥紺线粒体cytochrome c oxidase subunit I (COI)基因扩增引 物的筛选方法。
背景技术：
泥蚶(Tegillarca granosa)俗称血蚶，属软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲 (Lanellibranchia), |ξ| (Taxodonta), (Arcidae), ΜΜ Μ (TegillarcaIredale), 是一种生活在潮间带泥质沉积区的双壳贝类，在全国沿海各省市均有分布。泥蚶作为四大养殖贝类之一，肉味鲜美，可鲜食，也可制成干品，蚶肉富含蛋白质 和维生素。泥蚶作为大众化的海鲜品，在我国河北、山东、南方各省市均有人工养殖，产量 颇丰。关于泥蚶人工育苗、繁殖与生长、生理生化等方面的研究已有较多报道，但是基于分 子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状极大的阻碍了对泥蚶种质资源的开发利用 和保护。线粒体脱氧核糖核酸(Mitochondrial DNA，即mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中 性进化等特性，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较 快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应 用。由于Folmer (1994)设计的通用引物C0IL1490和C0IH2198在泥蚶中扩增结果不理想， 即琼脂糖凝胶电泳检测大部分个体无扩增条带，以往应用线粒体COI基因对泥蚶的遗传分 化研究采用了克隆测序的方法。这种方法虽能得到较精确的测序结果，但费时费力，且成本 很高，不适合大规模的泥蚶群体遗传学研究。开发适用性好的COI基因扩增引物可有效的 解决这些问题，同时为泥蚶的资源保护和利用、多样性评估、遗传育种等方面奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，它能满足现 有技术的上述需求。一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生 物技术信息中心，下载已有的泥蚶线粒体COI序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比 对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件PrimerPremier 5设计多对引物，送交上海生工生物技术有限公司合成；d、将泥蚶个体提取DNA，然后分 别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂 糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物COINF和COINR =COINF为 5，TTGATAGGGATCTGTTTAAGA3，；COINR 为 5，GCCAATACAGGCAAAGAAA3，。本发明筛选出一对用于扩增泥蚶线粒体部分COI序列的引物COINF和C0INR，并确 定了其反应体系和PCR扩增条件，经实验证明该引物具有条带单—、扩增效率高(> 90% )的特点，能够满足泥蚶遗传多样性研究的需要。
具体实施例方式实施本发明的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法时，分以下五步a、登陆美国国立生物技术信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， 下载已有的39条泥蚶线粒体COI序列(Genbank登录号为EF583524_583540和 FJ411459-411480)。b、用序歹Ij 处理软件 BioEdit (http://www.mbio. ncsu.edu/BioEdit/bioedit. html)对上述序列进行多重比对分析，确定出前后端较保守区域。C、经比对后在前后端各100个碱基对的较保守区域内，用引物设计软件Primer Premier 5 (http://www. premierbiosoft. com/primerdesign/index, html)设计弓丨物，设计 引物时尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。设计的多对引物交由上海生工生物技术有 限公司合成。d、对采自山东威海和福建霞浦的泥蚶(个体数均为15个，共30个)用苯酚-氯 仿法提取DNA，加双蒸水稀释为lOOng/μ 1的工作液备用。e、在10 μ 1 PCR反应体系中用合成的多对引物分别扩增这30个泥蚶个体的COI 片段，该体系包括100ng 模板 DNA，0. 25U Taq 聚合酶(Takara)，1 XPCR buffer,0. 2mM dNTPs, 1. 5mM Mgcl2,引物各 1 μ Μ。PCR 扩增条件为94°C预变性 3min，94°C变性 lmin,52°C 退火温度lmin，72°C延伸lmin，共35个循环，最后72°C延伸5min。本实验扩增出的产物用质量百分数浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出 条带单一，扩增效率高的一对引物COINF和COINR 该引物的产物片段长度约500bp，28个 个体有明亮条带，扩增效率大于90%。用ABI PRISM 3130测序仪(Applied Biosystems) 双向测序。序列用BioEdi t软件拼接后，和NCBI上下载的39条泥蚶COI序列进行多重比 对分析，确定所得序列为泥蚶线粒体COI序列。
权利要求
一种泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、登陆美国国立生物技术信息中心，下载已有的泥蚶线粒体COI序列；b、将下载的序列用BioEdit软件比对分析，确定序列两端保守区域；c、在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，送交上海生工生物技术有限公司合成；d、将泥蚶个体提取DNA，然后分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，检测引物的扩增情况；e、进行琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带单一、扩增效率高的一对引物COINF和COINRCOINF为5’TTGATAGGGATCTGTTTAAGA 3’；COINR为5’GCCAATACAGGCAAAGAAA 3’。
2.如权利要求1所述的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的泥 紺线粒体 COI 序列的 Genbank 登录号为 EF583524-583540 和 FJ411459-411480。
3.如权利要求1所述的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的 PCR反应条件为94°C预变性3min，94°C变性lmin，52°C退火温度lmin，72°C延伸Imin，共35 个循环，最后72°C延伸5min。
4.如权利要求1所述的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的琼 脂糖凝胶电泳用的琼脂糖质量百分数浓度为1.5%。
5.如权利要求1所述的泥蚶线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其特征是所述的扩 增效率高的一对引物COINF和COINR的扩增效率大于90%。
全文摘要
本发明筛选了一对用于泥蚶线粒体COI序列扩增的引物，其方法是利用美国国立生物技术信息中心上已有的泥蚶线粒体COI序列，下载后用BioEdit软件比对分析，在确定的保守区域后用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物。用泥蚶个体的DNA分别和合成的多对引物在反应体系下进行PCR反应，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一对引物COINF和COINR。经实验证明，该对引物具有条带单一、扩增效率大于90％的优点，能够满足泥蚶遗传多样性研究的需要，对泥蚶的资源保护和利用、多样性评估、遗传育种等方面将起到重要作用。
文档编号C12N15/10GK101942432SQ201010254700
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月12日 优先权日2010年8月12日
发明者倪刚, 孔令锋, 李琪 申请人:中国海洋大学