专利名称：一株产共轭亚油酸的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产共轭亚油酸的菌株及其应用。
背景技术：
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，简称CLA)是含有共轭双键的十八碳二烯酸的多种位置异构体和几何异构体的总称，是一类具有重要生理功能的多不饱和脂肪酸。在共轭亚油酸的众多异构体中，最具生物活性的是cis9，transIl-CLA和trans 10， cisl2-CLA。大量的研究表明，CLA具有抗癌、抗粥状动脉硬化、增强免疫力、减少脂肪含量、 降低胆固醇、预防心血管疾病等生理功能，对人体健康具有十分重要的意义。另外，作为饲料添加剂应用于畜禽业，CLA还具有改善动物机体代谢、重新分配营养素、减少脂肪沉积、增加瘦肉率、改善肉品质和提高免疫能力等功能。因此，CLA越来越受到国内外研究者的关注。天然的CLA来源十分局限，主要存在于牛、羊等反刍动物的肉和乳制品中，含量极低，每克脂肪只含3-9mg CLA,以cis9，transll-CLA异构体为主，约占总CLA的75% -90%。 CLA市场需求量很大，而反刍动物乳脂和肌肉脂肪中的CLA含量很少，因此如何低成本、高纯度地制备CLA成为国内外的研究热点。CLA的生产方法主要有化学合成法和微生物转化法，而微生物转化法具有化学合成法无法比拟的优点，因此许多学者致力于微生物异构法合成CLA的研究。近年来，国内外竞相研究微生物转化亚油酸生产CLA的方法和新菌株，主要以乳酸菌和丙酸菌的研究为主。国外对瘤胃细菌合成CLA的研究虽然早在20世纪60年代就开始，但由于瘤胃细菌多数是专性厌氧的，其生长所需营养因子及其复杂，难以在体外培养，因此限制了瘤胃细菌合成CLA的研究发展。国内尚未见在这方面的研究报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株产共轭亚油酸的菌株。本发明提供的婴儿链球菌(Sti^ptococcus infantarius)RB111，其保藏号为 CGMCC No. 4426 ο本发明的另一个目的是提供一种生产共轭亚油酸的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤发酵婴儿链球菌(Sti^ptococcusinfantarius) RBlll CGMCC No. 4426，得到发酵产物，即得到共轭亚油酸。所述发酵所用的发酵培养基为向MRS液体培养基中添加胰蛋白酶解酪蛋白、乳酸钠和亚油酸溶液得到的培养基，所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为IOg/ L-20g/L,所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为lg/L-3g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/L-l. 5g/L。所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为10g/L、15g/L或20g/L，所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为lg/L、2g/L或3g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L ；
所述亚油酸溶液按照如下方法制备将亚油酸与吐温80按1 10的质量比混合， 再加水稀释，得到亚油酸溶液，所述亚油酸在所述亚油酸溶液中的浓度为25g/L。所述MRS培养基按照如下方法制备将IOg蛋白胨、5g葡萄糖、IOg牛肉膏、5g酵母提取物、5g CH3COONa,2g(NH4)2HC6H5O7^O. 2g MgSO4 · 7H20、2g K2HPO4、0. 05g MnSO4 · 4H20、 Ig Tween 80、0. 600g L-半胱氨酸、ImL 0. 1% (质量百分含量)刃天青水溶液与蒸馏水混合，用蒸馏水补至1000ml，所述MRS培养基的pH为6. 5。所述发酵的温度为37°C。所述发酵时间为1天-3天，所述发酵时间为1天、2天或3天。所述发酵为静置培养。所述共轭亚油酸为顺9，反11-共轭亚油酸(cis9，transll_CLA)和反10，顺12-共轭亚油酸(translO, cisl2_CLA)。菌株RBlll的分类命名为婴儿链球菌(Sti^ptococcus infantarius)，已于2010 年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4426ο本发明的实验证明，本发明从山羊瘤胃中分离出的一株婴儿链球菌 (Streptococcus infantarius) RB111,具有产共轭亚油酸能力，菌株RBlll所产生的 cis9, translI-CLA 禾口 translO, cisl2_CLA 总量为 269. 2mg/L，其中 cis9, trans 11-CLA 占 52. 64%, translO, cisl2-CLA占47. 36%。因此该菌株具有很好的应用前景，本研究为我国利用微生物发酵法生产共轭亚油酸奠定了基础。
图1为菌株RBlll的CLA紫外吸收图谱图2为菌株RBlll在扫描电子显微镜下的细胞形态(X 20000)图3为菌株RBlll的16S rRNA基因PCR扩增图4为菌株RBlll的16S rRNA基因系统发育树 5 为 cis9, translI-CLA 禾口 translO, cisl2_CLA 的气相色谱图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、本发明所述产共轭亚油酸瘤胃细菌RBlll的分离及鉴定瘤胃样品来源山羊瘤胃内容物，采自内蒙古鄂尔多斯。试剂亚油酸(质量分数99%，密度0.9g/mL)和共轭亚油酸甲酯(由cis9， translI-CLAMe 和 translO，cisl2_CLAMe 组成，质量分数 99% )均购自 Sigma 公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒购自天根生物技术公司；T载体克隆试剂盒 (pGEM-T Easy System I kit)购自Promega公司；PCR产物纯化试剂盒购自OMEGA公司；细菌通用引物为上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其它常规试剂均为国产或进口分析纯。1、瘤胃细菌的分离
屠宰后的山羊瘤胃内容物，经单层纱布过滤除去大的饲料残渣，将瘤胃液装满采样容器，24-48h内运回实验室，立即进行样品处理及培养分离。用灭菌的多层纱布过滤运回实验室的瘤胃液样品，滤液经300r/min离心5min，以去除瘤胃液中的细小饲料残渣；上清液以8000r/min离心5min，以收集瘤胃液中的菌体，用事先灭菌的无氧水重悬菌体，制成菌悬液。采用Hungate厌氧滚管技术进行瘤胃细菌的分离，将菌悬液进行系列稀释后， 取0.05mL菌悬液接入熔化的固体分离培养基(成份SK2HPO4 0. 292g、(NH4)2SO4 0. 480g、 KH2PO4 0. 292g、NaCl 0. 480g、MgSO4 · 7H20 0. IOOg^CaCl2 · 2H200. 064g、NaCO3 4. 000g、L_ 半胱氨酸0. 600g、0. 刃天青水溶液lmL、蒸馏水1000ml、琼脂1. 5% -2. 0% )，用滚管机在冰水中滚管，取出37°C静置培养，2-3天待菌落形成后，重复以上稀释、滚管法在相同培养基上进行菌种纯化。结果得到14株瘤胃细菌，菌落颜色以白色为主，少数为黄色；菌落大小均较小，菌落直径在l_5mm之间；菌落形状以光滑的圆形为主，也有少数为不规则形状。2、本发明所述产共轭亚油酸瘤胃细菌菌株RBlll的筛选共轭亚油酸在232nm-234nm的紫外区有特征吸收峰，而亚油酸没有。因此用紫外分光光度计在190nm-250nm波长下扫描检测样品，观察在232nm-234nm处有无特征吸收峰， 有特征吸收峰者表明其发酵液中有共轭亚油酸生成。具体方法如下(1)菌种活化将上述步骤1得到已纯化的14株瘤胃细菌菌株分别接种于5mL液体MRS分离培养基(成份为蛋白胨log、葡萄糖5g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、CH3C00Na 5g、(NH4)2HC6H5O7 2g、MgSO4 · 7H20 0. 2g、K2HPO4 2g、MnSO4 · 4H20 0. 05g、Tween 801g、L-半胱氨酸 0. 600g、 0. 1 %刃天青水溶液lmL、蒸馏水1000ml、pH6. 5)，37！静置培养2d，之后再转接到新鲜的 MRS液体培养基中培养，活化培养2次。(2)发酵培养将活化过的菌株按5%接种量接种于5mL含有15g/L胰蛋白酶解酪蛋白和2g/L乳酸钠的MRS液体培养基里，加入亚油酸溶液(亚油酸与吐温80按1 10的质量比混合，再用水稀释至亚油酸浓度为25g/L，用0. 22 μ m的微孔滤膜的细菌过滤器除菌，-20°C保存，得到亚油酸溶液。)，使培养基中亚油酸浓度为lg/L。以不接入菌种、其他条件相同的发酵培养液为空白对照，37°C静置培养2d，得到发酵培养液。(3)脂肪酸的提取取2. 5mL上述发酵培养液，加5mL异丙醇涡旋振荡，静置;3min分层，之后加入 3. 75mL正己烷涡旋振荡，萃取共轭亚油酸，静置:3min分层后取上层萃取液。(4)共轭亚油酸的紫外分光光度计检测用紫外分光光度计在190nm-250nm范围内扫描上层萃取液，以不接种的空白培养基上层萃取液作为参比液。空白培养基和发酵培养基的处理条件、萃取方法完全相同，这样可消除底物亚油酸以及培养基其它组分在紫外测定时引起的系统误差，提高数据精确度和可靠性。采用上述紫外分光光度计扫描法，检测上述步骤1分离得到的已纯化的14株瘤胃细菌菌株，结果筛选出一株编号为RBlll的菌株在波长为233nm的紫外区有吸收峰(见图 1)，吸收峰的OD值为0. 4844，说明编号为RBlll的菌株为产共轭亚油酸的菌株。
3、本发明所述产共轭亚油酸瘤胃细菌菌株RBlll的鉴定(1)菌落及菌体形态观察将筛选出的编号为RBlll的菌株接种于MRS固体培养基上滚管，37°C培养2d，观察固体培养基上菌落的形状和颜色等特征。然后，挑取菌体进行革兰氏染色，用普通光学显微镜观察染色结果。结果为菌株RBlll在MRS固体培养基上为白色、透明、圆形菌落，菌落边缘整齐光滑，菌落直径约为2-3mm ；革兰氏染色结果为阳性。另外，将筛选出的菌株RBlll接种于MRS液体培养基中，37°C培养2d，取菌液于 8000r/min离心5min，收集菌体，做好标记，将样品送至中国科学研究院微生物所电镜室， 采用扫描电子显微镜，观察细胞的形态，并测量细胞的大小。结果如图2所示，菌株RBlll 的细胞形态为球状，菌体直径约为0. 607 μ m。(2) 16S rRNA基因序列分析用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取菌株RBlll的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物对F27 5~-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"和R1492
-TACCTTGTTACGACTT-3~，进行 16S rRNA 基因 PCR 扩增。PCR 反应体系(50 μ L) IOXbuffer 5 μ L ；dNTPs (2. 5mmol/L) 5 μ L ；弓| 物(20 μ mol/L)各 1 μ L ；Taq DNA Polymerase (2. 5U/ μ L) 0· 5 μ L ；模板 DNA 2 μ L ；ddH20 补足 50 μ L。PCR 扩增程序为:95 V， 5min ；95°C，Imin ；54°C，1. 5min ；72°C，Imin, 31 个循环；72°C，IOmin0得到的PCR产物经电泳检测，结果如图3所示，其中，M为21Λ DNALadder ；1为不加基因组模板的阴性对照；2为菌株RBlll的16S rRNA基因PCR扩增条带。可以看出，菌株RBlll的16S rRNA基因PCR产物为约1. 5Kb大小的片段。将上述PCR产物用试剂盒回收纯化，纯化产物连接于pGEM T-Easy载体，并转化入 E.coli DH5a (Ε. coli DH5 α购自Takara公司，产品目录号为D9057)中，在Amp平板中挑取白斑培养后提取质粒DNA酶切验证，用EcoR I (Takara, 15U/ul)酶切，得到含有约1500bp 插入片段的阳性克隆，将阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序，结果为该PCR产物具有序列表中的序列1所示的核苷酸序列，序列1全长为1507bp。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据库中进行同源性检索，下载相似性较高的相关菌株的模式菌株16S rRNA基因序列，采用ClustXl. 81软件进行多序列比对，应用 MEGA4. 0软件构建16S rRNA基因系统发育树。结果如图4所示，从图4中可见，菌株RBlll 与已报道的Mi^ptococcus infantarius模式菌株NCDO 599亲源关系最近，它们之间16S rRNA基因序列相似性为99. 8%。(3)生理生化特征测定采用法国梅里埃(bioMerieux)公司的API20STREP细菌鉴定试剂盒进行了生理生化特征测定，具体方法按照产品操作说明进行。菌株RBlll的生理生化测定结果为V-P实验为阳性，水解七叶灵，不水解马尿酸， 在含6. 5% NaCl肉汤培养基中不生长，吡咯烷酮芳胺酶阴性，α-半乳糖苷酶阳性，β-葡萄糖醛酸酶阴性，β -半乳糖苷酶阴性，碱性磷酸酶阴性，亮氨酸氨肽酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，发酵乳糖、淀粉、糖原等产酸，但不能发酵核糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、菊糖等产酸。 这些结果与Mi^ptococcus infantarius的生理生化特征一致。综合以上形态特征、16S rRNA基因序列分析及生理生化测定结果，菌株RBlll被鉴定为婴儿链球菌 Streptococcus infantarius。菌株RBlll的分类命名为婴儿链球菌(Sti^ptococcus infantarius)，已于2010 年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4426ο实施例2、本发明所述菌株RBlll发酵生产共轭亚油酸方法一1、菌种活化将实施例1 得到的 Mi^ptococcus infantarius RBlll CGMCC No. 4似6 接种于 5mL液体MRS培养基中，37°C静置培养2d，之后再转接到新鲜的MRS液体培养基中培养，活化培养2次。2、发酵培养采用实施例1中的2(2)进行发酵培养，发酵培养的温度为37°C，发酵培养的时间为2d，得到发酵培养液。发酵培养基为向MRS液体培养基中添加胰蛋白酶解酪蛋白(英国Oxiod公司，产品目录号LP0042)、乳酸钠和亚油酸溶液(亚油酸与吐温80按1 10的质量比混合，再用水稀释至亚油酸浓度为25g/L，用0. 22 μ m的微孔滤膜的细菌过滤器除菌，-20°C保存，得到亚油酸溶液。)得到的培养基，所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为15g/ L，所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为2g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为 lg/L ；所述MRS培养基按照如下方法制备将IOg蛋白胨、5g葡萄糖、IOg牛肉膏、5g酵母提取物、5g CH3COONa,2g(NH4)2HC6H5O7^O. 2g MgSO4 · 7H20、2g K2HPO4、0. 05g MnSO4 · 4H20、 Ig Tween 80、0. 600g L-半胱氨酸、ImL 0. 1% (质量百分含量)刃天青水溶液与蒸馏水混合，用蒸馏水补至1000ml，所述MRS培养基的pH为6. 5。3、气相色谱分析紫外分光光度法检测到的共轭亚油酸是各种异构体的总和，不能区分共轭亚油酸的不同异构体。因此，要分析初步筛选出的瘤胃细菌所产共轭亚油酸中是否含有cis9， transll-CLA和translO，cisl2_CLA这两种具有生物活性的异构体，还需要进一步用气相色谱来分析测定，具体方法如下1)脂肪酸提取及甲酯化取2mL上述发酵培养液，加4mL氯仿-甲醇溶液(氯仿与甲醇以2 1体积比混合)，涡旋振荡后2500rpm、4°C离心5min，将下层有机相转移到小试管中，用0. 5g无水硫酸钠干燥，上清液用氮气吹干，加入4mL 2%的NaOH甲醇溶液Og NaOH溶于IOOmL无水甲醇中得到)，涡旋振荡，50°C水浴15min，冷却至25°C，加4mL10 %盐酸甲醇溶液(IOmL盐酸与 IOOmL无水甲醇混合得到)，涡旋振荡，80°C水浴60min，冷却至25°C，加2mL蒸馏水，涡旋振荡，加2mL正己烷萃取，静置分层后取上层正己烷用0. 5g无水硫酸钠干燥，进行气相色谱测定或-20°C保存。2) CLA气相色谱标准曲线测定准确称取11. 2mg的共轭亚油酸甲酯(购自Sigma公司)于IOmL容量瓶，用正己烷定容，配成浓度1. 12g/L的贮备液，再分别取0. 05mL、0. ImL,0. 15mL、0. 2mL、0. 5mL、lmL、 1. 5mL贮备液于5mL容量瓶，用正己烷定容，配成浓度分别为11. 2mg/L,22. 4mg/L,33. 6mg/ L、44. 8mg/L, 112mg/L,224mg/L,336mg/L的标准品。用气相色谱测定标样，每个浓度重复进样3次，取峰面积的平均值，以CLA浓度为横坐标、峰面积为纵坐标建立CLA气相色谱标准曲线。CLA气相色谱分析条件如下仪器Agilent 6890N气相色谱仪，Agilent 7683自动进样器，氢火焰离子化检测器FID，聚硅氧烷聚合物色谱柱DB-23(60mX0. 25mmX0. 25 μ m)。分析条件升温程序为180 V保持5min，然后以10°C /min升温至220 V，保持30min ；载气为氮气，柱流速0.8mL/min，进样量为lyL，分流比为10 1，进样口温度 2500C，检测器温度250°C，氢气流速30mL/min，空气流速400mL/min，尾吹流速25mL/min。采用外标法，以色谱峰面积计算c9，tIl-CLA和tlO，cl2_CLA的含量。结果如图5 所示，其中，A 图为 cis9, trans 11-CLA(c9, tll-CLA)和 translO, cisl2-CLA(tlO，cl2-CLA)标样，B图为菌株RBlll产生的CLA，可以看出菌株RBlll具有产 cis9，transll-CLA和translO，cisl2_CLA的能力，且产生的CLA总产量为洸9. 2mg/L发酵培养液，其中 cis9，transIl-CLA 占 52. 64%, translO, cisl2_CLA 占 47. 36%。方法二1、菌种活化与方法一相同；2、发酵培养与方法一基本相同，不同的是发酵培养的时间为Id ；发酵培养基为向MRS液体培养基中添加胰蛋白酶解酪蛋白、乳酸钠和亚油酸溶液得到的培养基，所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为10g/L，所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为lg/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/L。3、气相色谱分析检测方法与方法一相同，检测结果与方法一无显著差异。方法三1、菌种活化与方法一相同；2、发酵培养与方法一基本相同，不同的是发酵培养的时间为3d ；发酵培养基为向MRS液体培养基中添加胰蛋白酶解酪蛋白、乳酸钠和亚油酸溶液得到的培养基，所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为20g/L，所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为3g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为1. 5g/L。3、气相色谱分析检测方法与方法一相同，检测结果与方法一无显著差异。
权利要求
1.婴儿链球菌(Sti^ptococcusinfantarius)RBlll，其保藏号为 CGMCC No. 4426。
2.一种生产共轭亚油酸的方法，包括如下步骤发酵婴儿链球菌(Sti^ptococcus infantarius)RBlll CGMCC No. 4426，得到发酵产物，即得到共轭亚油酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵所用的发酵培养基为向MRS液体培养基中添加胰蛋白酶解酪蛋白、乳酸钠和亚油酸溶液得到的培养基，所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为IOg/ L-20g/L,所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为lg/L-3g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/L-l. 5g/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述胰蛋白酶解酪蛋白在所述发酵培养基中的浓度为10g/L、15g/L或20g/L，所述乳酸钠在所述发酵培养基中的浓度为lg/L、2g/L或3g/L，所述亚油酸在所述发酵培养基中的浓度为 0. 5g/L、lg/L 或 1.5g/L;所述亚油酸溶液按照如下方法制备将亚油酸与吐温80按1 10的质量比混合，再加水稀释，得到亚油酸溶液，所述亚油酸在所述亚油酸溶液中的浓度为25g/L。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为37°C。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述发酵时间为1-3天，所述发酵时间为1天、2天或3天。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵为静置培养。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述共轭亚油酸为顺9，反11-共轭亚油酸和反10，顺12-共轭亚油酸。
全文摘要
本发明公开了一株产共轭亚油酸的菌株及其应用。本发明提供的婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)RB111，其保藏号为CGMCC No.4426。本发明还提供了一种制备共轭亚油酸的方法，包括如下步骤发酵婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)RB111 CGMCC No.4426，得到发酵产物，即得到共轭亚油酸。本发明的实验证明，本发明分离出一株山羊瘤胃的婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)RB111，具有产共轭亚油酸能力。
文档编号C12R1/46GK102559532SQ20101059962
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者成晓杰, 王敏, 程敏, 陈强, 高俊莲, 黄翠丽 申请人:北京农业生物技术研究中心