专利名称：人类肠道病毒四色荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中的荧光PCR试剂盒，尤其是涉及用于人类肠道病毒通用检测及肠道病毒EV71型、CoxA16型分型检测的包含内対照的四色荧光RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病韋(enterocytopathic human orphan virus ECHO简称埃可病韋)及新型肠道病韋共71个血清型。而由肠道病毒引起的手足ロ病是ー类急性传染病，临床表现以发热和手、
足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征，本病急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有。引起手足ロ病的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviriade)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的4型、5型、7型、9型等；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)，二者在遗传学上密切相关，常为混合感染和交替感染。我国手足ロ病流行，其病原主要为EV71型和CoxA16型。通常情况下，EV71与CoxA16引起的手足ロ在临床症状上难以区別。肠道病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定、血清学检测和分子生物学技木。病毒的分离培养和血清学方法，繁杂费吋，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。分子生物学特别是PCR技术，由于其检测材料用量少、快速、灵敏度高且具有很高的特异性，在病毒感染的诊断中发挥越来越重要的作用。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是先将RNA反转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶在体外快速扩增目的DNA片段的技术。实时荧光RT-PCR技术在普通RT-PCR的基础上，在扩增反应体系中加入ー对或多对特异性PCR引物同时加入相对应的特异性荧光探针，该探针为两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。而在PCR扩增吋，探针同模板上目的扩增片段杂交，由于DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过ー个PCR循环，荧光信号也和目的片段一祥，有ー个同步指数增长的过程。中国专利名称为肠道病毒71型核酸检测试剂盒及检测方法(申请号201010105088. 5)公开了ー种肠道病毒71型核酸检测试剂盒，包括PCR反应酶、PCR反应液及肠道病毒71型正向引物和反向引物及特异性的荧光探针；中国专利名称为肠道病毒CoxA16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒(申请号200810121454. 9)公开了ー种肠道病毒柯萨奇A16检测试剂盒的上下游引物和特异性探针；中国专利名称为肠道病毒核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒(申请号200810121453. 4)公开了ー种肠道病毒的上下游引物和特异性探针。上述检测试剂盒用于检测相应的肠道病毒具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点，但是上述试剂盒都无法在同一反应管中实现肠道病毒的通用检测以及肠道病毒EV71型、CoxAie型的分型检测，同时大量实验数据显示，在粪便、直肠拭子、咽喉拭子样本中，PCR抑制物存在的比例为I. 8% 3. 4%，表明内对照对监控PCR抑制物的存在具有重要作用，而目前现有手足ロ病的体外诊断试剂盒都没有内对照而且存在特异性和灵敏度较低，检测步骤繁琐等缺陷，需要进ー步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时在同一反应管中实现人类肠道病毒的通用检测及EV71亚型、CoxAie亚型分型快速检测的特异性强、灵敏度高、可靠性強、无假阴性结果的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为
I、肠道病毒四色荧光RT-PCR试剂盒(简称试剂盒)，本试剂盒是在对人类肠道病毒核酸 序列分析的基础上，通过生物信息学方法分析选取保守基因序列设计出特异性引物，利用荧光PCR技术对肠道病毒进行检測。在按下述方法设计的引物、探针存在下，在荧光PCR仪中对病毒核酸进行RT-PCR扩增，来实现对肠道病毒的检测。具体的说，本试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、内对照、AMV逆转录酶、Taq聚合酶，其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重10X荧光RT-PCR反应缓冲液、EV通用型引物、EV通用型探针、EV71型引物、EV71型探针、CoxA16型引物、CoxA16型探针、内对照引物、内对照探针、牛血清白蛋白；多重IOX荧光RT-PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁，其中各引物及探针的序列如下，
依据肠道病毒EV71型VPl基因保守序列设计引物、探针
EWlPf 上游引物5' -0GCAAATGCGTAGAAAGGT-3'19bp ；
EWlPr 下游引物:5' -GGAGCAATTGTGGGACAACT-3'20bp ；
EV71Pb 探针5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1-3'28bp ；
依据肠道病毒CoxAie型VPl基因保守序列设计引物、探针
CoxA16Pf 上游弓丨物:5' -GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'22bp ；
CoxA16Pr 下游引物:5' -GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'19bp ；
CoxA16Pb 探针5' -HEX-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-3'27bp ；
依据肠道病毒EV基因5'非翻译区设计通用引物、探针
EVPf 上游弓丨物:5' HimMTGOGGCrMTOC-3'19bp ；
EVPr 下游弓丨物:5' -GATTGTCA0CATMGCAGCCA-3'21bp ；
EVPb 探针5, -ROX-MCCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQト3'28bp ；
内对照序列为
5 ' -GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCACACCACACCCACACACGTGTT GGATCAATTT CGAGATGCGA GCTGCCAAGC-3 'IOObp ；
依据内对照序列设计内对照引物、探针ICPf 上游弓丨物:5' ^TGCTCACA(XAGTTGC0GC-3'20bp ；
ICPr 下游弓丨物:5' "GCTTGGCAGCTOGCATCTOHB'20bp ；
mMfB2p,所述的阳性对照品为连接有设计肠道病毒通用型、EV71型、CoxAie型的引物、探针的基因保守序列的pUCm-T克隆载体。所述的阴性对照品为无RNA酶的DEPC水。所述的内对照为连接有内对照人工设计序列的pUCm-T克隆载体，所述的内对照的浓度为 104copies/ml。所述的多重10 X PCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、 氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体(dATP、dGTP、dUTP、dCTP)终浓度为0. 4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制多重10 X PCR反应缓冲液5ul ;浓度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;浓度均为IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;浓度均为 IOOii M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;浓度均为 50 y M 探针 EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各0. 3ul ;浓度均为100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;浓度为50 u M的探针ICPb 0. Iul ;无RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。2、人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测方法
(1)样品处理
采集疑似病人咽拭子、疱疹液、脑脊液或人类肠道病毒分离培养物，迅速放入装有l-2ml的病毒保存液的商品化采样管(友康基业，MT0301-1)中作为待测样品使用；
(2)病毒核酸RNA的提取
严格按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGEN Viral RNA Mini ExtractionKit(QIAGEN, CAT:52904)操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA ;每份样品均加入IOul的浓度为104copies/ml的内对照同步參与核酸样品的提取；
(3)多重荧光RT-PCR反应液配制
取IOul提取的样品核酸、IOul阳性对照品和IOul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增，其中多重荧光RT-PCR反应液配制如下多重荧光RT-PCR反应母液39ul ;浓度5U/ul的AMV逆转录酶0. 4ul ;浓度5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 0. 6ul ；
(4)四色荧光RT-PCR扩增检测
在四色荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为FAM通道用于检测EV71型、HEX通道用于检测CoxAie型、ROX通道用于检测EV通用型及CY5通道用于检测内对照，反应条件50°C 30分钟I个循环；95°C 3分钟I个循环；95°C 5秒，55°C 40秒，循环40次；设置完成后，保存文件，运行程序；
(4)检测结果分析
内对照扩增曲线正常，按以下规则判断结果
出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性结果；有扩增曲线但不呈S形且阈值超过40或者没有出现S形扩增曲线为阴性结果；出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑结果，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制多重10 X PCR反应缓冲液5ul ;浓度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;浓度均为IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;浓度均为 IOOii M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;浓度均为 50 y M 探针 EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各0. 3ul ;浓度均为100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;浓度为50 u M的探针ICPb 0. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。所述的多重10 X PCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)终浓度为0. 4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明人类肠道病毒四色荧光PCR检测试剂盒及检测方法，由于该试剂盒引入了针对肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A组16型及肠道病毒通用型核酸序列所设计的特异性扩增引物和四色荧光探针，可以同时对肠道病毒通用检
测以及肠道病毒71型及柯萨奇病毒A组16型进行分型检测，从而实现了一个标本中同时检测三种病毒的目的，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间，一般来说，从处理样本到结果的判断仅需要2小时左右；而且更重要的是引入了内对照，能够有效地监控样本中的抑制物，还能避免了操作误差及PCR扩增产物污染所造成的假阴性，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。综上所述，本发明ー种用于快速实时定量检测人类肠道病毒的四色荧光PCR检测试剂盒，病毒的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，可实现对肠道病毒EV71型、CoxAie型及肠道病毒通用型同时快速、准确及特异检測。
图I为本发明人类肠道病毒四色荧光RT-PCR扩增图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进ー步详细描述。具体实施例一
肠道病毒四色荧光RT-PCR试剂盒
I、RT-PCR试剂盒组成
本试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、阳性对照品、阴性对照品、内对照、AMV逆转录酶、Taq聚合酶。其中多重荧光RT-PCR反应母液含有多重IOX荧光RT-PCR反应缓冲液、EV通用型引物、EV通用性探针、EV71型引物、EV71型探针、CoxA16型引物、CoxA16型探针、内对照引物、内对照探针、牛血清白蛋白；多重IOX荧光RT-PCR反应缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷盐酸、氯化钾、甘油、四种单核苷酸单体、氯化镁。其中多重荧光RT-PCR反应母液配制如下(括号内所示为相应的物质浓度)
多重IOXPCR反应缓冲液5ul
牛血清白蛋白(20mg/ml)Iul
EVPf 和 EVPr (IOOuM)各 0. 4ulEV71Pf 和 EV71r (IOOuM)各 0. 4ul
CoxA16Pf 和 CoxA16Pr (100 ii M)各 0. 5ul
EVPb、EV71Pb 和 CoxA16Pb (50uM) 各 0. 3ul ICPf 和 ICPr (100 uM)各 0. 2ul
ICPb (50u M)0. Iul
无 RNA 酶 DEPC 水31. Iul
配制混合后于冰箱_20°C保存。其中多重10XPCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50% (甘油的体积为多重10XPCR反应缓冲液体积的 50%)、四种单核苷酸单体(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)终浓度为0. 4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。阴性对照品为无RNA酶的DEPC水，阳性对照品为含有肠道病毒通用型、EV71型、CoxA16型的引物、探针的基因保守序列的pUCm-T克隆载体质粒；内对照为连接有内对照人エ设计序列的PUCm-T克隆载体，内对照浓度为104COpieS/ml。本发明试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。2、引物、探针设计与合成
从GenBank下载所有肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A组16型及肠道病毒其它各亚型病毒的基因序列，经过生物信息学分析反复比对，选择如下区域作为扩增肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A组16型及肠道病毒通用型的特异性目标区域,应用Primer Premier及Oligo等软件设计并筛选EV通用引物、EV通用荧光探针、EV71型引物、EV71型探针、CoxA16型弓I物、CoxAie型探针、内对照引物及内对照探针，内对照序列采用Perl软件设计
肠道病毒EV71型引物、探针
上游弓 I物 EWlPf 5' -0GCAMTGCGTAGAMGGT-3'19bp ；
下游弓 I物 EWlRr 5' -GGAGCMTTGTGGGACMCT-3'20bp ；
探针 EV71Pb:5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1-3'28bp
肠道病毒CoxAie型引物、探针
上游弓 I物 CoxA16Pf :5' -GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'22bp ；
下游引物 CoxA16Pr :5' -GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'19bp
探针 CoxA16Pb :5' -HEX-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQ1-3'27bp
肠道病毒通用型引物、探针
上游弓 I物 EVPf 5' HirroMTGCGGCTMTOC-3'19bp
下游弓 I物 EVPr 5' -GATTGTCA0CATMGCAGCCA-3'21bp
探针 EVPb 5' -ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQI-3'28bp
内对照序列
5' -GTGCTCACAC CAGTTGCCGC GGAAAGTATG TGGAATGTTA ACACACCCAC ACCACACCCACACACGTGTT GGATCAATTT CGAGATGCGA GCTGCCAAGC-3'IOObp
内对照引物、探针
ICPf :5' -GTGCTCACACCAGTTGC0GC-3'20bp
ICPr :5, "GCTTGGCAGCTOGCATCTOHB,20bpICPb :5' -CY5-ATTGTGTGGGTGTGGTGTGGGTGTGTGC-BHQ2-3'28bp。上述肠道病毒EV71型突光探针5'端标记FAM突光报告基团,肠道病毒CoxA16型荧光探针5'端标记HEX荧光报告基团，肠道病毒通用型荧光探针5'端标记JOE荧光报告基团，内标荧光探针5'端标记CY5荧光报告基团，肠道病毒EV71型荧光探针3'端、肠道病毒CoxAie型荧光探针3'端和肠道病毒通用型荧光探针3'端分别标记BHQl荧光淬灭基团，内对照荧光探针3'端标记BHQ2荧光淬灭基团。具体实施例ニ
人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测方法，毎次检测均应设立阳性对照及阴性对照
1、样品处理
采集疑似病人咽拭子、疱疹液、脑脊液或人类肠道病毒分离培养物，迅速放入装有
l-2ml的病毒保存液的商品化采样管(友康基业，MT0301-1)中作为待测样品使用；
2、病毒核酸RNA的提取
严格按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGEN Viral RNA Mini ExtractionKit(QIAGEN, CAT:52904)操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA ;每份样品均加入IOul内对照(浓度为104copies/ml)同步參与核酸样品的提取；
3、RT-PCR反应体系配制
取IOul提取的样品核酸、IOul阳性对照品和IOul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增，其中多重荧光RT-PCR反应液配制如下多重荧光RT-PCR反应母液39ul ;浓度5U/ul的AMV逆转录酶0. 4ul ;浓度5U/ul 的 Taq DNA 聚合酶 0. 6ul ；
其中多重荧光RT-PCR反应母液配制多重10XPCR反应缓冲液5ul ;浓度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;浓度均为IOOiiM的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各0. 4ul ;浓度均为 100 u M 的引物 CoxA16Pf 和 CoxA16Pr 各 0. 5ul ;浓度均为 50 ii M 探针 EVPb、EV71Pb 和CoxA16Pb各0. 3ul ;浓度均为100 u M的引物ICPf和ICPr各0. 2ul ;浓度为50 u M的探针ICPb 0. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存；
其中多重10XPCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体(dATP、dGTP、dUTP、dGTP)终浓度为
0.4mM,氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水；
4、四色荧光RT-PCR扩增检测
在四色荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置为FAM通道用于检测EV71型、HEX通道用于检测CoxAie型、ROX通道用于检测EV通用型及CY5通道用于检测内对照，反应条件50°C 30分钟I个循环；95°C 3分钟I个循环；95°C 5秒，55°C 40秒，循环40次；设置完成后，保存文件，运行程序；
5、检测结果分析
内对照扩增曲线正常，按以下规则判断结果
出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性结果；没有出现S形扩增曲线或者有扩增曲线但不呈S形且阈值超过40为阴性结果；出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑结果，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
具体型别鉴定按照下表进行表I检测结果判断
权利要求
1.一种人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒，包括多重荧光RT-PCR反应母液、AMV逆转录酶液、Taq DNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，其特征在于还包括内对照、所述的多重荧光RT-PCR反应母液包括多重IOXPCR反应缓冲液、牛血清白蛋白及各上、下游引物及各特异性探针，其中所述的各上、下游引物序列、所述的特异性探针序列以及内对照序列如下肠道病毒 EV71 型上游弓 I 物 EV7 IPf 如 SEQ ID NO. I 所示，5' -CGCAMTGCGTAGAMGGT-3'；肠道病毒 EV71 型下游弓丨物 EV71Pr 如 SEQ ID NO. 2 所示，5' -GGAGCAATTGTGGGACAACT-3'； 肠道病毒EV71型荧光探针EV71Pb如SEQ ID NO. 3所示，5' -FAM-AGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGC-BHQ1 -3/ ；肠道病毒 CoxA16 型上游弓丨物 CbxA16Pf 如 SEQ ID NO. 4 所示，5' _ GMOCATCACTOCACACAGGAG-3'；肠道病毒 CoxA16 型下游弓丨物 CoxA16Pr 如 SEQ ID NO. 5 所示，5' - GTACCTGTGGTGGGCATTG-3'；肠道病毒CoxA16型荧光探针CoxA16Pb如SEQ ID NO. 6所示，5' -HEX- CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-BHQI- 3'； 肠道病毒通用型上游引物EVPf如SEQ ID NO. 7所示，5 ^ -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3;； 肠道病毒通用型下游引物EVPr如SEQ ID NO. 8所示，5' -GATTGTCACCATMGCAGCCA-3'； 肠道病毒通用型荧光探针VPb如SEQ ID NO. 9所示，5' -ROX-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTC-BHQI- 3'； 内对照序列如SEQ ID NO. 10所示 5' ■GKDmomiEEMMGMmAMIDCAIMMOmM' ΟΜΜΥ SKMSK Ο 3Μ￡-3'； 内对照上游引物 ICPf 如 SEQ ID NO. 11 所示，5' - GATTAGTATGTCGGCTGCAGGTA -3'； 内对照下游引物 ICPr 如 SEQ ID NO. 12 所示，5' - CAAGGCTCATAGCGCGTATC -3'；内对照荧光探针 CPb 如 SEQ ID NO. 13 所示，5' -CY5- COGGTACATCOGAOGGAGCGTC - BHQ2-3'。
2.根据权利要求I所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制如下多重IOXPCR反应缓冲液5ul ;浓度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;浓度均为100 μ M的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各O. 4ul ;浓度均为100 μ M的引物CoxA16Pf和CoxA16Pr各O. 5ul ;浓度均为50 μ M探针EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各O. 3ul ;浓度均为100 μ M的引物ICPf和ICPr各O. 2ul ;浓度为50 μ M的探针ICPb O. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。
3.根据权利要求2所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述的多重10 X PCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体终浓度为O. 4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。
4.根据权利要求I所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品为连接有设计肠道病毒通用型、EV71型、CoxAie型的引物、探针的基因保守序列的PUCm-T克隆载体；所述的阴性对照品为无RNA酶的DEPC水，所述的内对照为连接有内对照人工设计序列的pUCm-T克隆载体,所述的内对照的浓度为104copies/ml。
5.一种根据权利要求I所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于包括以下步骤 (I)样品处理采集疑似病人咽拭子、疱疹液、脑脊液或人类肠道病毒分离培养物，迅速放入装有l-2ml的病毒保存液的采样管中作为待测样品使用； (2)病毒核酸RNA的提取 严格按照商品化核酸RNA提取试剂盒QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA ;每份样品均加入IOul的浓度为IO4Copies/ml的内对照同步参与样品核酸的提取； (3)四色荧光RT-PCR扩增检测 取IOul提取的样品核酸、IOul阳性对照品和IOul阴性对照品分别加入40ul多重荧光RT-PCR反应液至相应的PCR管中进行多重荧光RT-PCR扩增，四色荧光RT-PCR反应程序在四色荧光定量PCR仪上进行，探针检测模式设置FAM通道用于检测EV71型、HEX通道用于检测CoxA16型、ROX通道用于检测EV通用型及CY5通道用于检测内对照，反应条件50°C30分钟I个循环；95°C 3分钟I个循环；95°C 5秒，55°C 40秒，循环40次；其中RT-PCR反应液的配制如下多重荧光RT-PCR反应母液39ul、浓度为5U/ul的AMV逆转录酶O. 4ul、浓度为5U/ul的Taq DNA聚合酶O. 6ul、RNA核酸样品IOul ； (4)检测结果分析 内对照扩增曲线正常，按以下规则判断结果出现S形扩增曲线，Ct值小于37为阳性结果；有扩增曲线但不呈S形且阈值超过40或者没有出现S形扩增曲线为阴性结果；出现S形扩增曲线，但Ct值大于37，小于40为可疑结果，对可疑结果，应重复实验，如果重复实验出现S形扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
6.根据权利要求5所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于所述的多重荧光RT-PCR反应母液配制如下多重10XPCR反应缓冲液5ul ;浓度20mg/ml的牛血清白蛋白Iul ;浓度均为100 μ M的引物EVPf、EVPr、EV71Pf和EV71Pr各O. 4ul ;浓度均为100 μ M的引物CoxA16Pf和CoxA16Pr各O. 5ul ;浓度均为50 μ M探针EVPb、EV71Pb和CoxA16Pb各O. 3ul ;浓度均为100 μ M的引物ICPf和ICPr各O. 2ul ;浓度为50 μ M的探针ICPb O. Iul ；RNA酶DEPC水31. lul，混合后于冰箱_20°C保存。
7.根据权利要求6所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR的检测方法，其特征在于 肠道病毒EV71型上游引物如SEQ ID NO. 1，其下游引物如SEQ ID NO. 2所示， 肠道病毒EV71型荧光探针如SEQ ID NO. 3所示； 肠道病毒CoxA16型上游引物如SEQ ID NO. 4，其下游引物如SEQ ID NO. 5所示， 肠道病毒CoxA16型荧光探针如SEQ ID NO. 6所示； 肠道病毒通用型上游引物如SEQ ID NO. 7所示，其下游引物如SEQ ID NO. 8所示， 肠道病毒通用型荧光探针如SEQ ID NO. 9所示；内对照序列如SEQ ID NO. 10所示， 内对照上游引物如SEQ ID NO. 11所示，其下游引物如SEQ ID NO. 12所示， 内对照荧光探针如SEQ ID NO. 13所示。
8.根据权利要求6所述的人类肠道病毒四色荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述的多重10XPCR反应缓冲液组成为三羟甲基氨基甲烷盐酸终浓度为100禮、氯化钾终浓度为500mM、甘油体积比为50%、四种单核苷酸单体终浓度为O. 4mM，氯化镁终浓度为3mM及相应体积的超纯水。
全文摘要
本发明公开了人类肠道病毒的四色荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括多重荧光RT-PCR反应母液、AMV逆转录酶液、TaqDNA聚合酶液、阳性对照品、阴性对照品，特点是还包括内对照、多重10×PCR反应缓冲液、浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白及浓度均为100μM的各上、下游引物及浓度均为50μM的各特异性探针，其中各上、下游引物、特异性探针序列以及内对照序列如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12及NO.13所示，优点是检测敏感性高，特异性好、准确快速、无假阳性。
文档编号C12R1/93GK102851391SQ201210251520
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者孙大为, 周冬根, 倪敏君, 岑晨霞, 陈丽, 翟敏, 曹雪春 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院