专利名称：msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。
背景技术：
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准，美国国家健康和营养调查(NHANES III，1988 1994年)结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7. 1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到
2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995 1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。当骨折发生时，患者最初的感受便是疼痛。在骨折早期治疗过程中，疼痛从始至终都存在着。它不仅影响患者的治疗效果，同时也直接影响肢体的功能恢复。不同类型的骨折均存在不同程度的疼痛、功能障碍、肢体肿胀，而疼痛是首先应考虑解决的问题。因为疼痛可引起交感神经兴奋，继而反射性抑制胃肠功能，引起食欲减退；疼痛还可影响睡眠质量，引起体内多种激素的释放，产生相应的病理生理改变，使机体抵抗力下降，直接影响创伤愈合及功能恢复。因此解除骨折患者的疼痛感是治疗的重要组成部分。如果患者服用多种药物治疗骨质疏松并止痛，容易产生药物拮抗反应；若要错开服药时间一方面要靠考虑药物的半衰期，另一方面还要考虑药物有效浓度，而且给患者造成不便。目前缺乏一种可以同时有效治疗骨质疏松和止痛的药品。
发明内容
本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和止痛药品的缺陷，而提供的一种msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株。msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)，大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)按以下步骤制备一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/CTx)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/CTx ；四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)。本发明中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本发明中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。由于骨折患者均为突然致伤，无思想准备，再加上相关知识缺乏，治疗过程长；患者因疼痛恐惧常呈被动体位，特别是老年骨折患者，往往会引起将来功能障碍，而且恢复期较长。本发明msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3-msCT/CTx)发酵产生的msCT-CTx融合蛋白可治疗骨质疏松的 同时止痛，对于骨质疏松所引发骨折的患者治疗效果显著，而且由于可以明显减轻或消除患处疼痛感，患者心理负担小、康复快，愈后功能恢复期短。本发明用于治疗骨质疏松和止痛的msCT-CTx融合蛋白微生物制剂,不产生拮抗反应，使用安全。本发明msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)发酵产生的msCT-CTx融合蛋白共60个氨基酸。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21(DE3-msCT/CTx)。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)可大规模发酵生产msCT-CTx融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和止痛奠定了物质基础。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/CTx)按以下步骤制备一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/CTx)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX_6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/CTx ；四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)。本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21 (DE3)。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/CTx)酶切反应体系为
pUC (msCT/CTx )20 μ
IOX M buffer6μ1
BamHX3μ1
KcoR I3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二的不同点在于步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为
载体 pGEX-6P-120 μ
IOXM buffer μ
BamHl3μ1
EcoR I3μ1 不含 DNA 酶的 ddH2028μ1。其他步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一、二或三的不同点在于步骤二
中酶连接反应体系为
双酶切的载体PGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
Ι0ΧΤ4 DNA 迕接酚 buffer2μ1
Τ4 DNA连接酶2μ1。其他步骤及参数与具体实施方式
一、二或三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一的不同点在于步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。其他步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。本实施方式msCT-CTx融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体PUC (msCT/CTx)。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一的不同点在于步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。其他步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同O具体实施方式
七本实施方式msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)，大肠杆菌 BL21 (DE3_msCT/CTx)按以下步骤制备一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC (msCT/CTx)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 双酶切质粒 pGEX_6P_l ；三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P_l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/CTx ；四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21 (DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)；其中步骤一中质粒载体pUC (msCT/CTx)酶切反应体系为pUC (msCT/CTx )20 μ IOXM buffer μ BamHX 3μ1KcoR I 3μ1不含 DNA 酶的 ddH20 28μ1；其中步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为
载体 pGEX-6P-l20 μIOXM buffer 6μ1 BamH\ 3μ1 KcoR I 3μ1
不含 DNA 酶的 ddH2028μ1；其中步骤二中酶连接反应体系为
双酶切的载体pGEX-6P-13 μ
融合蛋白的DNA片段13μ1
10ΧΤ4 DNA 迮接lW buffer2μ1
Τ4 DNA连接酶2μ1。其中步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示；步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。本实施方式中msCT-CTx融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUCUsCT/CTx)。本实施方式在构建msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)时改变了天然鲑鱼降钙素(salmoncalcitonin, sCT)的基因，而且在msCT和CTx之间插入Kpn I酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoR I酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。载体pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位点，本实施方式合成的pGEX-msCT/CTx均能为Kpn I单酶切开,说明本实施方式msCT-CTx融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-l中。然后将质粒pGEX-msCT/CTx导入大肠杆菌BL21 (DE3)中，选取阳性克隆。随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)菌落37°C过夜培养，提取质DNA，用Kpn I进行单酶切，并用相应的空白质粒PGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn I酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTX)内含有 SEQ ID NO 1 所示 DNA。将大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)置于LB培养基28°C环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和止痛的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为38. 6%。
利用本实施方式大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)发酵获得的msCT-CTx融合蛋白进行试验msCT-CTx融合蛋白治疗骨质疏松实验取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别口服以下药物阴性对照组(control):质量浓度为O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；模型组质量浓度为O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5 ml/kg ；实验组质量浓度为O. 5%的msCT-CTx融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；(获得的用于治疗骨质疏松和止痛的msCT-CTx融合蛋白用无菌水溶液溶解)阳性对照组I :阿仑膦酸钠(Alen) 5mg/kg。阳性对照组2 :质量浓度为O. 5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明实验组、阳性对照组I和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且实验组的效果最好。表I骨小梁宽度的比较和骨面积(X土SD)
MI给药剂量 I骨小梁宽度X±SD I骨小梁面积X±SD
模型组8 5ml/kg50.02 + 19. 70.3850 + 0.0487
阴性对照组 8 5ml/kg112. 48+15. 2 O. 6910 + 0. 0501
阳性对照组 I~ 8 5mg/kg113. 24+16. 7 O. 6017 + 0. 0480
阳性对照组 2~ 8 5ml/kg118. 29+13. 2 O. 6882 + 0. 0452
实验组8 5ml/kg125. 79+15. 7 0.7171 + 0.0420msCT-CTx融合蛋白热板镇痛实验挑取大小相近的雌性SD大鼠70只，任意分为7组，每组10只。调节热板温度为55±0.5°C，置大鼠于热板上，测定各大鼠的正常痛反应。以大鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛闕时间为5 30s为正常，60s为最大值。空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组I给予低剂量的吗啡(25μ g/kg)，阳性对照组2给予高剂量的吗啡(125 μ g/kg)，阳性对照组3给予CTx (O. 75 μ g/kg),融合蛋白低剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白O. 25 μ g/kg，融合蛋白中剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白O. 75 μ g/kg,融合蛋白高剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白1.5yg/kg。药后O. 5h、lh、2h、3h重复上述测定,记录痛觉反应时间。记录给药后不同时间的痛闕，求出各组平均值，实验结果如表2所示。实验结果说明本实施方式转基因工程菌株产生的msCT-CTx融合蛋白具有优异的镇痛效果。
表权利要求
1.msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21 (DE3-msCT/CTx)，大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)按以下步骤制备 一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC(msCT/CTx)用BamH I和EcoR I双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoRI双酶切质粒 pGEX_6P_l ； 三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-l进行酶连接，然后16°C放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/CTx ； 四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21(DE3)，选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21 (DE3_msCT/CTx)。
2.根据权利要求I所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC (msCT/CTx)酶切反应体系为pUC (msCT/CTx)20 μl IOXM buffer6μl BamHl3μl KcoR I3μl 不含DNA酶的ddH20 28μl
3.根据权利要求I所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中质粒pGEX-6P-l酶切反应体系为 载体 pGEX-6P-120 μl 10*M buffer6μl BamHIμl EcoR I3μl 不含 DNA 酶的 ddH20 28μl。
4.根据权利要求I所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中酶连接反应体系为双酶切的载体pGEX-6P-13 μl 融合蛋白的DNA片段13μl10*T4 DNA 接酚 buffer2μl T4 DNA连接酶2μl。
5.根据权利要求I所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。
6.根据权利要求5所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
全文摘要
msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和止痛药品的缺陷。msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3-msCT/CTx)按以下步骤制备1)获得融合蛋白DAN片段；2)双酶切质粒；3)酶连接；4)转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。
文档编号C12R1/19GK102965325SQ20121053395
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学