TmDGAT1b基因的启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了TmDGAT1b基因的启动子及其应用，属于生物【技术领域】。所述启动子为如下任一所示：1）核苷酸序列为序列表中SEQ?ID?No.1的DNA；2）核苷酸序列与SEQ?ID?No.1互补的DNA；3）在高严紧条件下能够与上述1）或2）DNA杂交且具有启动子功能的DNA；4）对上述1）或2）所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA；5）与上述1）或2）所示DNA具有至少90％同源性且具有启动子功能的DNA。本发明的启动子能特异调控外源基因表达，能使外源基因在拟南芥茎组织中得到表达，具有重要应用价值。
【专利说明】TmDGATIb基因的启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中的一种启动子，特别是涉及一种来源于四合木的TmDGATlb基因的启动子，及其用于调控植物目的基因表达的应用。
【背景技术】
[0002]三脂酰甘油(Triacylglycerol，TAG)是人类和动物赖以生存的重要化合物之一，也是石油的可能替代品之一。随着人们对植物油需求的日益增长，提高植物油的产量与开发新型油料作物成为人们关心的重要问题。研究表明，在植物营养器官中积累油脂是提高植物油产量的最为有效的手段之一。四合木(Tetraena mongolica)是我国内蒙古地区特有的一种强旱生落叶小灌木，属蔡藜科(Zygophyllaceac)四合木属的单型种植物。研究表明，四合木茎组织中含有大量的三脂酰甘油，含量高达46mg/g干重。因此，研究四合木茎组织中TAG合成和积累的分子机制，对能源植物的开发和利用具有重要的意义。
[0003]二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT，EC2.3.1.20)是催化TAG生物合成的关键酶和限速酶，在调控植物油脂积累水平过程中起决定作用。研究表明，四合木中存在两个DGATl基因，分别为 TmDGATla 和 TmDGATIb(GenBank 登录号分别为 JX163929 与 JX163930)，均对 TAG的合成具有重要的作用。通过对这两个基因调控机理的研究，从而解析四合木在营养器官中积累三脂酰甘油的分子机理，为植物营养器官积累油脂的基因工程研究提供理论基础和重要的基因资源。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种启动子，所述启动子为如下任一所示:
[0005]I)核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0.1的DNA ；
[0006]2)核苷酸序列与SEQ ID N0.1互补的DNA ；
[0007]3)在高严紧条件下能够与上述I)或2) DNA杂交且具有启动子功能的DNA ；
[0008]4)对上述I)或2)所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA ；
[0009]5)与上述I)或2)所示DNA具有至少90%同源性且具有启动子功能的DNA。
[0010]典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C );“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C ;“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ;“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；1XSSC =中等严紧性；
0.5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。
[0011]在本发明中，所述对SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5'端和/或3'端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个,或者不超过2-30个,或者不超过3-20个,或者不超过4-15个,或者不超过5-10个,或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
[0012]本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明所述的启动子，与所述的启动子可操作连接的基因，其中所述启动子与所述基因来源相同或者不同。
[0013]本发明还涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的启动子或核酸构建体，所述载体可以通过例如将上述启动子或核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到；具体地，所述载体为将上述启动子或核酸构建体与PMD19-T质粒经重组得到的重组载体。
[0014]本发明还涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。
[0015]本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。
[0016]本发明还涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。
[0017]本发明还涉及用于扩增本发明所述启动子的引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物分别含有序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；优选的，所述引物对的两条引物在5'端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基；具体地，所述引物对的两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4和SEQID N0.5 所示。
[0018]本发明还涉及制备SEQ ID N0.1所示的启动子的方法，包括以四合木基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增；所述扩增引物根据SEQ ID N0.1在四合木DNA中的序列分别针对首尾进行设计，例如为本发明所述的引物对。
[0019]本发明还涉及一种调控植物中目的基因表达的方法，所述方法包括将本发明的核酸构建体和/或载体转化入植物愈伤组织或外植体中的步骤，或用本发明的重组细胞感染植物愈伤组织或外植体的步骤。
[0020]本发明还涉及一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养本发明的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体。
[0021]本发明还涉及本发明的启动子和/或核酸构建体和/或载体和/或重组细胞用于调控植物目的基因表达的用途，特别是用在使目的基因在植物茎组织中表达的应用；其中，所述的植物为双子叶植物，具体为拟南芥；以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
[0022]本发明还涉及本发明的愈伤组织或外植体用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
[0023]实验证明，本发明SEQ ID N0.1所示DNA具有启动子功能，能使外源基因在茎组织中表达。本发明SEQ ID N0.1所示DNA能够特异调控外源基因的表达，具有重要的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是双元表达载体构建流程。
[0025]图2是转基因拟南芥⑶S组织化学染色结果。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步说明:
[0027]实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]实施例1、启动子的制备及功能验证
[0029]一、启动子的制备
[0030]以四合木的基因组DNA为模板，用引物对ProTmDeATlbf和ProTmD(；ATlbr进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0031]PCR体系如下:
[0032]
【权利要求】
1.一种启动子，为如下任一所示: 1)核苷酸序列为序列表中SEQID N0.1的DNA ； 2)核苷酸序列与SEQID N0.1互补的DNA ； 3)在高严紧条件下能够与上述I)或2)DNA杂交且具有启动子功能的DNA ； 4)对上述I)或2)所示DNA进行一个或多个碱基的取代、缺失和/或添加且具有启动子功能的DNA ； 5)与上述I)或2)所示DNA具有至少90%同源性且具有启动子功能的DNA。
2.—种核酸构建体，其包含权利要求1所述的启动子、与所述启动子可操作连接的基因，其中所述启动子与所述基因来源相同或者不同。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体；所述载体通过将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体插入克隆载体或表达载体而得到，或者通过人工合成得到。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体与PMD19-T质粒经重组得到的重组载体。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体；具体地，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
6.一组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述引物对的两条引物分别含有序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；优选的，所述引物对的两条引物在5'端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基；具体地，所述引物对的两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3或SEQ IDN0.4 和 SEQ ID N0.5 所示。
7.—种调控植物中目的基因表达的方法，包括如下步骤:将权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5所述的重组细胞导入植物。
8.权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5所述的重组细胞在调控植物目的基因表达中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3或4所述的载体或权利要求5所述的重组细胞在使目的基因在植物茎组织中表达的应用；其中，所述的植物为双子叶植物。
10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。
【文档编号】C12N15/84GK104178484SQ201310188798
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】许亦农, 李敏春 申请人:中国科学院植物研究所