组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备潜伏病毒激活剂中的应用的制作方法

组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备潜伏病毒激活剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备病毒储存库重激活药物中的应用以及含有苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的组合物。所述组合物对人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等多种持续性感染病毒的储存库具有显著的激活作用,可以与抗病毒制剂联合使用以获得良好的治疗效果。
【专利说明】组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备潜伏病毒激活剂中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一类针对持续性感染病毒体内储存库的重激活药物，属于微生物学领 域。

【背景技术】
[0002] 持续性病毒感染是指机体长期持续的感染状态，由于入侵的病毒不能杀死宿主细 胞，因而两者之间形成共生平衡，感染者可长期或终生带毒，并经常或反复不定期的向外排 毒，但常缺乏出现与免疫病理有关的临诊症状。清除病毒潜伏感染细胞所构成的潜伏储存 库是持续性病毒感染疾病治愈的关键。引起人类持续感染的病毒包括人类免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus, HIV)、乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)、丙型肝炎 病毒（Hepatitis C Virus, HCV)和巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV)等。
[0003] HIV
[0004] 获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)是由 HIV 感染引起的，已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题。联合国数据显示到目前为止， 全世界共有3400万人感染了 HIV或患AIDS，迄今已造成3000多万人死亡。1996年以来，高 效抗反转录病毒疗法（Highly Active Anti-retroviral Therapy, HAART)联合使用三种或 三种以上的抗病毒药物，使得AIDS从一种致死性疾病变为一种可控的慢性病。尽管HAART 能够有效减缓疾病进程，但并不能从根本上治愈感染者，一旦停药便立即反弹。HIV不能被 完全清除的主要原因，是由于HIV的潜伏感染细胞所构成的潜伏储存库存在。HIV潜伏病毒 储存库主要由HIV潜伏感染的静息⑶4+T淋巴细胞、单核-巨噬细胞、造血细胞等构成，其 主要特征：一是整合后潜伏，即整合在宿主细胞基因组上的前病毒发生基因沉默，避免了免 疫系统和抗反转录酶病毒的药物攻击，一旦条件适当，病毒又能恢复复制能力；二是感染个 体携带潜伏感染细胞数量虽少，但衰减率较慢，以至于仅靠 HAART治疗将其彻底清除是不 可能的，因此HIV潜伏病毒储存库是目前临床治疗不能彻底清除HIV的巨大障碍。
[0005] 尽管已达成共识认为重激活病毒储存库是HIV治愈关键性的第一步，但目前世界 上尚没有储存库重激活的上市药物。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi)、甲基化抑制剂以及 Bryologs化合物是目前研究极具潜力的三类化合物。
[0006] 药物Prostratin是从萨摩亚的药用植物Homolan thusnutans中提取出的一种佛 波酯。Prostratin可结合和激活蛋白激酶C，介导刺激HIV的转录，进而将潜伏在免疫细胞 内的病毒释放。此后设计合成了一组Bryostatin类似物Bryologs化合物，新化合物被证 实可以相等或强于原物质的效力激活潜伏HIV储存库。
[0007] 表观遗传学研究发现，受感染细胞的DNA胞嘧啶甲基化有助于维持HIV潜伏，降低 疗效。体外研究数据表明，病毒5'端的长末端重复序列（LTR)有CpG甲基化形成，甲基化 抑制剂5-aza_20-脱氧胞苷会导致原病毒的再激活。已证明这类药物尤其是与其他药物联 合应用非常有效。
[0008] HDACi类药物也备受关注，处于临床试验以及不同的实验室研究阶段。短链脂肪酸 类的丙戊酸钠（VPA)是一种较弱的HDACi，能增加体外培养的、潜伏感染的细胞HIV基因表 达和病毒复制。羟肟酸类的伏立诺他（Vorinostat，SAHA)是病毒储存库激活研究推进较为 靠前的HDACi，处于临床试验评估阶段，能诱导部分慢性HIV感染者潜伏感染的T细胞系和 静止的⑶4+T细胞复制HIV。
[0009] HBV
[0010] HBV感染是危及人类健康的最普遍的问题之一。据世界卫生组织统计，全球60亿 人口中约有20亿人曾感染过乙肝病毒，约有4亿慢性HBV携带者，每年约有100万人死 于HBV感染相关的肝脏疾病。我国是HBV感染的高流行区，约有1. 2亿乙肝表面抗原携 带者，其中慢性乙型肝炎患者约2000万人。目前临床治疗乙肝的两大类抗病毒药物核苷 (酸）类药物和干扰素仅能阻止疾病进展，延长生存期，但任何一类都不能完全清除HBV，达 到根治乙肝的目的。HBV有特殊的反转录复制形式，以及特殊的复制中间体共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA 与组蛋白和非组蛋白形成超螺 旋结构的病毒微染色体，稳定存在于肝、胰、肾、骨髓等的细胞核内，成为乙型肝炎难治性的 根源，在病毒持续感染、抗病毒治疗后病毒再激活等方面起关键作用。促进cccDNA的清除 成为当前抗病毒的重要目标之一。
[0011] HCV
[0012] 丙型肝炎是由HCV引起的世界性传染病。由于HCV的高度变异性、泛嗜性、免疫耐 受和免疫损伤等因素，导致HCV感染高度慢性化。目前，全世界有1. 7亿人感染HCV，我国现 有感染者4000万，感染率为3. 2%，是丙型肝炎中度高发国家。
[0013] 近几年采用抗HCV联合疗法，可使大部分患者获得持久病毒清除，但仍有慢性丙 型肝炎患者体内形成潜伏持续带毒状态。清除病毒的潜伏储存库，将为患者带来疾病彻底 治愈的希望。
[0014] 综上所述，清除机体病毒储存库中的病毒分子是病毒感染治疗中的重点，而如何 有效激活病毒储存库中的病毒分子则是这种治疗的一个难点，现有技术虽然已经发现诸如 羟肟酸类的伏立诺他一类的激活剂，但是由于其细胞毒性以及激活效率的问题，在临床应 用上仍然存在着亟待解决的问题，因此现有技术也需要激活效率更高，细胞毒性更小的潜 伏病毒激活剂。


【发明内容】

[0015] 本发明的目的是提供一类针对持续性感染病毒体内储存库的重激活药物。基于上 述目的，本发明首先提供了苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备重激活持续性感染病 毒药物中的应用。所述苯酰胺类化合物是指分子结构中含有苯乙酰胺、苯甲酰胺等苯酰胺 类原子团的化合物。
[0016] 在一个优选的技术方案中，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗原 是西达本胺（Chidamide)、恩替诺特（Entinostat)、莫西司他（Mocetinostat)、 AGK-2(C23H13C12N302, CAS 号：304896-28-4)、AR-42(C18H20N203, CAS 号：935881-37-1)或 CI-994(C15H15N302, CAS 号：112522-64-2)。
[0017] 在一个更为优选的技术方案中，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂为西达本 胺。
[0018] 在上述技术方案中，所述引起人类持续性感染的病毒可以为人类免疫缺陷性病 毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
[0019] 本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物包括苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑 制剂和制药学上可接受的载体。
[0020] 在一个优选的技术方案中，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂为西达本胺、 恩替诺特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
[0021] 在一个更为优选的技术方案中，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂为西达本 胺。
[0022] 优选地，所述西达本胺的有效剂量为0· 2-50 μ mol/L。
[0023] 更为优选地，所述西达本胺的有效剂量为0. 5-5. 0 μ mol/L。
[0024] 本发明采用HIV假病毒潜伏感染细胞模型、HIV病毒潜伏感染细胞模型和HIV感 染患者临床标本研究证明：苯酰胺类HDACi与羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺 他相比，细胞毒性更低、激活作用更强。所述羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂是指含有羟 肟酸基团，羧酸分子中的羧基二价氧被肟基取代的羧酸衍生物。西达本胺不仅能有效激活 假病毒潜伏感染细胞模型A7的HIV启动子和假病毒潜伏感染细胞模型TZM-bl的HIV启动 子，还能重激活潜伏感染细胞系U1/HIV-1的HIV病毒，而且西达本胺能够有效重激活HIV 患者静息⑶4+T细胞中潜伏的HIV。高效抗逆转录病毒治疗（HAART)的HIV患者外周血⑶4+ 静息T细胞中检测不到HIV RNA(拷贝数〈5〇C〇pieS/mL) ;1 μ mol/L西达本胺处理后，能够 重激活⑶4+静息T细胞中潜伏的HIV病毒，病毒拷贝数达到1161C〇pie S/mL ;而0. 5 μ mol/ L伏立诺他处理未能有效激活潜伏病毒活化。苯酰胺类HDACi包括：西达本胺、恩替诺特、 莫西司他、AGK-2、AR-42和CI-994。其可能的机制是通过表观遗传学修饰，使与HIV病毒 LTR启动子区结合的组蛋白乙酰化，形成局部松弛的空间构像，从而使转录复合体和相关转 录启动因子易于进入，启动转录。
[0025] HIV、HBV、HCV和CMV等引起人类持续感染的病毒在初次感染或治疗后能够潜伏在 感染细胞内，在体内形成潜伏储存库。表观遗传修饰药物HDACi通过改变蛋白的乙酰化状 态，重激活病毒表达，调整机体免疫状态，提高抗病毒药物的治疗效果，最终达到持续性病 毒感染疾病治愈。
[0026] 因此，在上述药物组合物中还可以含有抗病毒制剂，所述抗病毒制剂可以为核苷 (酸）类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑 制剂、受体拮抗剂和干扰素的一种或多种。
[0027] HIV患者进行常规HAART治疗，外周血HIV RNA拷贝数很低或检测不到（拷贝数 〈5〇C〇pieS/ml)的前提下，基于本发明的技术效果，可以继续进行如下处理清除病毒储存库 中的HIV潜伏病毒：一方面可选择地进行HIV疫苗主动免疫（例如吉林大学疫苗研究中心 和长春百克药业有限责任公司共同研制的由DNA疫苗及重组病毒载体疫苗组成的预防性 疫苗一
[0028] "复合型抗艾滋病毒疫苗"），激活人体特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞；另一 方面给予西达本胺、恩替诺特、莫西司他、AGK-2、AR-42和CI-994等苯酰胺类HDACi处理， 重激活静息⑶4+T细胞、单核细胞和巨噬细胞等细胞中潜伏的HIV，使潜伏病毒活化和表达； 最终CD8+细胞毒性T淋巴细胞特异性杀伤HIV病毒潜伏的细胞，释放出的HIV病毒则通过 抗病毒药物治疗来杀灭，最终达到治愈或功能性治愈的目的。
[0029] 人类免疫缺陷性病毒感染治疗药物主要可分为六大类：1.核苷（酸）类反转录酶 抑制剂，如齐多夫定、拉米夫定、司他夫定、替诺福韦、阿巴卡韦、双汰芝（拉米夫定+齐多夫 定）、三协维（阿巴卡韦+齐多夫定+拉米夫定）、恩曲他滨、阿巴卡韦+拉米夫定、替诺福 韦+恩曲他滨等；2.非核苷类反转录酶抑制剂，如依非韦仑、奈韦拉平、依曲韦林等；3.蛋 白酶抑制剂，如克力芝（洛匹那韦+利托那韦）、阿扎那韦、达芦那韦等；4.整合酶抑制剂， 如拉替拉韦等；5.融合抑制剂，如恩福韦肽等；和6.受体拮抗剂，如马拉韦罗等。我国目前 标准的免费高效抗逆转录病毒治疗的一线治疗方案均包含三种抗病毒治疗药物，即两种核 苷类反转录酶抑制剂和一种非核苷类反转录酶抑制剂，例如替诺福韦+拉米夫定+依非韦 仑。
[0030] HBV和HCV的治疗可以将组蛋白去乙酰化酶抑制剂和临床传统药物联合应用，活 化并清除病毒潜伏储存库，达到持续性病毒感染疾病治愈的目的。
[0031] 乙型肝炎病毒感染治疗药物主要分两大类，分别为核苷（酸）药物，如拉米夫定、 阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯等；和干扰素，如普通干扰素 α、聚乙二醇干 扰素 a _2a、聚乙二醇干扰素 a _2b等。可以通过核苷类似物拉米夫定和干扰素两类药物的 联合应用进行治疗。
[0032] 丙型肝炎病毒感染治疗药物可以为聚乙二醇干扰素 α联合利巴韦林联合应用， 以及非结构蛋白3/4Α蛋白酶抑制剂（如telaprevir和boceprevir)、非结构蛋白5Β聚合 酶抑制剂和非结构蛋白5A蛋白抑制剂等。

【专利附图】

【附图说明】
[0033] 图1.西达本胺对HIV潜伏感染细胞生长的影响；
[0034] 图2.西达本胺重激活A7细胞的HIV LTR启动子；
[0035] 图3.西达本胺重激活TZM-bl细胞的HIV LTR启动子；
[0036] 图4.西达本胺重激活潜伏感染细胞系U1/HIV-1的HIV病毒；
[0037] 图5.西达本胺重激活HIV患者静息⑶4+T细胞中的HIV基因表达。

【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步 的限定。
[0039] 实施例1.西达本胺对HIV病毒潜伏感染细胞生长的影响
[0040] 本实施例采用MTT细胞增殖实验检测HDACi药物西达本胺对病毒潜伏感染细胞A7 生长的影响，确证西达本胺的细胞毒性以及用于重激活潜伏感染病毒的浓度范围。
[0041] 1.1实验方法
[0042] 1. 1. 1 细胞系：
[0043] HIV假病毒潜伏感染细胞系J-Lat Tat-GFP Clone A7(以下简称A7)由美国NIH AIDS部门NIH AIDS研究和标准试剂项目组Eric Verdin博士馈赠。A7细胞是通过病毒载 体稳定整合 LTR-Tat-IRES-GFP 的人 Jurkat T 细胞。LTR(long terminal repeats)在病毒 转录过程中起启动子和增强子的功能；Tat基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒基因转 录率；GFP(Green Fluorescent Protein)则作为HIV启动子激活的标志，可以采用流式细 胞仪进行检测。A7细胞培养条件是加有10% FBS的RPMI1640培养基。
[0044] 1. 1. 2实验方案：
[0045] 将对数生长期的A7细胞接种在96孔培养板中，每孔100yL含10% FBS的 RPMI1640培养基中含5X103个细胞。然后每孔中加入不同浓度的西达本胺，浓度分别为： 0· 1 μ mol/L、0. 5 μ mol/L、L 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L、4. 0 μ mol/L、5. 0 μ mol/L、 10. 0 μ mol/L，以0. 5 μ mol/L伏立诺他作为阳性对照，以不加药物处理组为阴性对照。在 37°C 5% C02分别培养2天和4天后，收集细胞用MTT检测细胞的增殖情况，每个处理条件 设3个复孔。MTT检测方法是：每孔加入5mg/mL的MTT10 μ L，37°C继续孵育4h，然后每孔 加入100μ L10% SDS，孵育2h后，在570nm处检测并记录。
[0046] 1. 2实验结果
[0047] 根据MTT细胞增殖实验结果做出细胞生长抑制曲线，西达本胺对A7细胞生长抑制 具有剂量和时间依赖性，结果见图1。文献报道浓度为〇. 5 μ mol/L的羟肟酸类组蛋白去乙 酰化酶抑制剂伏立诺他病毒激活效应明显，在实施例中作为阳性对照，药物处理2天和4天 的细胞生长抑制率分别是17. 3% ±5. 8%和32. 5% ±13.0%，大大高于同浓度西达本胺的 细胞毒性（西达本胺处理2天和4天的细胞生长抑制率分别是11. 3% ±2. 9%和11. 2% ±4. 6% )，稍高于3. 0 μ mol/L西达本胺的细胞毒性（西达本胺处理2天和4天的细胞生长 抑制率分别是16. 0% ±2. 0%和20. 3% ±4. 4% )。据此建议西达本胺重激活潜伏病毒时 处理细胞的浓度彡3. 0 μ mol/L。
[0048] 该实施例以文献报道的伏立诺他潜伏病毒重激活浓度为参照，证明同浓度的西达 本胺细胞毒性更低。
[0049] 实施例2.西达本胺激活假病毒潜伏感染细胞模型A7的HIV启动子
[0050] 本实施例采用HIV假病毒潜伏感染细胞模型A7来证明西达本胺等HDACi对HIV 病毒启动子的重激活作用，探索HDACi用于制备持续性感染病毒体内储存库的重激活药物 的可能性。有关A7细胞的描述见实施例1。
[0051] 2.1实验方法
[0052] 将对数生长期的HIV假病毒潜伏感染细胞A7接种在12孔培养板中，每孔在lmL 含10% FBS的RPMI1640培养基中加入1X106细胞。然后每孔中加入不同浓度的西达本 胺，浓度分别为：〇· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L，以0· 5 μ mol/L伏立诺他作为阳性 对照，以不加药物处理组为阴性对照。在37°C 5% C02分别培养48h和96h后收集细胞，用 流式细胞仪检测GFP阳性细胞百分率。
[0053] 2. 2实验结果
[0054] 流式细胞分析显示，西达本胺能够明显激活A7细胞中GFP的表达，且具有剂量和 时间依赖性，结果见图2。浓度为0· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L的西达本胺处理48h 后，A7细胞中GFP阳性率分别是2. 0%、3. 7%和5. 3% ;空白对照和阳性对照药物伏立诺他 的GFP阳性率分别是1. 5%和2. 9% ;西达本胺浓度在1. 0 μ mol/L以上时激活作用优于伏 立诺他。浓度为0. 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L的西达本胺处理96h后，A7细胞中 GFP阳性率分别是2. 6%、5. 1%和10. 5% ;空白对照和阳性对照药物伏立诺他的GFP阳性 率基本不变，分别是1. 8%和2. 6% ;西达本胺对HIV潜伏病毒的重激活能力具有浓度依赖 性，浓度在1. 〇 μ mol/L以上时激活作用优于伏立诺他。
[0055] 该实施例采用假病毒潜伏感染细胞模型A7证明西达本胺能够明显活化HIV LTR 启动子，重激活潜伏病毒库，而且重激活作用优于阳性对照药物伏立诺他。
[0056] 实施例3. HDACi激活假病毒潜伏感染细胞模型TZM-bl的HIV启动子
[0057] 本实施例采用另一个HIV假病毒潜伏感染细胞模型TZM-bl来进一步证明西达本 胺等HDACi对HIV病毒启动子的重激活作用。
[0058] 3. 1实验方法
[0059] 3. 1. 1 细胞系：
[0060] HIV假病毒潜伏感染细胞模型TZM-bl细胞由美国NIH AIDS部门NIH AIDS研究和 标准试剂项目组馈赠，是稳定整合HIV LTR启动子和荧光素酶基因（Luc)的人Hela细胞， 当HIV启动子被激活时，细胞中就会有荧光素酶产生，可以通过荧光素酶检测试剂盒进行 分析。TZM-bl细胞的培养液是加有10% FBS的DMEM培养基。
[0061] 3. 1.2实验方案：
[0062] 将对数生长期的HIV假病毒潜伏感染细胞TZM-bl接种在96孔培养板中，每孔在 100 μ L含10% FBS的DMEM培养基中加入1 X 104细胞。细胞贴壁后每孔加入不同浓度的西 达本胺，浓度分别为：〇· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、2. 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L，以 0· 5 μ mol/L 伏 立诺他作为阳性对照，以不加药物处理组为阴性对照。继续在37°C 5% C02培养48h用荧 光素酶检测系统试剂盒中的细胞裂解液将细胞裂解，再将96孔板和荧光素酶底物拿到生 物发光仪中进行测量。
[0063] 3. 2实验结果：
[0064] 荧光素酶检测结果显示，西达本胺能够明显激活TZM-bl细胞中荧光素酶的表 达，且具有剂量依赖性，结果见图3。与未处理组相比，浓度为0· 5 μ mol/L、1. 0 μ mol/L、 2· 0 μ mol/L、3. 0 μ mol/L的西达本胺作用TZM-bl细胞后，荧光素酶活性分别增高了 1· 24、 1. 44、1. 65、1. 82倍；阳性对照药物伏立诺处理组则增高了 1. 15倍。结果说明西达本胺病 毒重激活作用优于伏立诺他，与假病毒潜伏感染细胞模型Α7的结果一致。
[0065] 实施例4. HDACi重激活潜伏感染细胞系U1/HIV-1的HIV病毒
[0066] 本实施例采用病毒潜伏感染细胞模型TZM-bl来证明西达本胺等HDACi能否重激 活整合在宿主细胞基因组上的HIV前病毒。
[0067] 4. 1实验方法
[0068] 4. 1. 1 细胞系：
[0069] HIV潜伏感染细胞系U1/HIV-1由美国NIH AIDS部门NIH AIDS研究和标准试剂 项目组馈赠，是潜伏感染HIV-1的人U937原单核细胞，当HIV前病毒被重新激活时，将转 录、翻译病毒蛋白，其中P24蛋白分泌至细胞培养上清中，可以通过酶联免疫吸附（ELISA) 的方法检测到，作为潜伏病毒重激活的标志。U1/HIV-1细胞的培养液是加有10% FBS的 RPMI1640培养基。
[0070] 4. 1. 2实验方案：
[0071] 将对数生长期的HIV潜伏感染细胞系U1/HIV-1接种在12孔培养板中，每孔在lmL 含10% FBS的RPMI1640培养基中加入1 X 106细胞。细胞贴壁后每孔加入不同浓度的西达 本胺，浓度分别为：1· 0 l·1 mol/L、2. Ο μ mol/L、5. Ο μ mol/L、10. Ο μ mol/L，以 0· 5 μ mol/L 伏 立诺他作为阳性对照，以不加药物处理组为阴性对照。继续在37°C 5% C02培养48h，取细 胞培养上清，用酶联免疫吸附试剂盒检测病毒P24的含量。
[0072] 4. 2实验结果：
[0073] 酶联免疫吸附分析显示，西达本胺能够明显激活U1/HIV-1细胞中HIV前病毒基 因组表达，且具有剂量依赖性，结果见图4。浓度为L0ymol/L、2.0ymol/L、5.0ymol/ L、10. 0 μ mol/L的西达本胺处理48h后，细胞培养上清中ρ24病毒蛋白的含量分别达到 150. 6pg/mL、214. 6pg/mL、233. Opg/mL和242. 7pg/mL ;空白对照和阳性对照药物伏立诺他 的p24病毒蛋白的含量分别是99. lpg/mL和122. 9pg/mL。结果说明西达本胺病毒重激活作 用优于伏立诺他。
[0074] 该实施例采用HIV潜伏感染细胞模型证明西达本胺能够明显重激活整合在宿主 细胞基因组上的HIV前病毒，而且重激活作用优于阳性对照药物伏立诺他。
[0075] 实施例5. HDACi对HIV感染患者潜伏病毒库的重激活作用
[0076] 静息⑶4+T淋巴细胞是HIV潜伏感染主要的病毒储藏库，为了验证西达本胺等 HDACi对HIV患者静息T淋巴细胞中潜伏病毒的重激活作用，本实施例首先分离HIV患者外 周血单个核细胞中的静息T淋巴细胞，然后采用PCR和酶联免疫吸附实验检测潜伏病毒重 激活后HIV基因和蛋白的表达，相关结果通过病毒载量分析系统进行验证。
[0077] 5. 1实验方法：
[0078] 5. 1. 1分离HIV患者的静息⑶4+T淋巴细胞
[0079] HIV患者的入组条件是：接受常规HAART治疗1年以上；血液中检测不到病毒 载量（HIV-1RNA拷贝数<50copies/mL) 1年以上；外周血⑶4+T细胞数量高于300/μ L。 在临床知情同意的情况下，取进行常规HAART治疗的HIV患者外周血，用淋巴细胞分离 液密度梯度离心分离外周血单个核细胞。接着采用德国美天旎公司的MACS磁场分离 ⑶4+CD25TD69_HLA-DR_静息T淋巴细胞，基本操作是：在⑶4+T细胞阴性分选试剂中加入 ⑶25、⑶69和HLA-DR三种抗体标记磁珠，制备成静息⑶4+T淋巴细胞阴性分选磁珠；在MACS 缓冲液中将密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞细胞和静息CD4+T淋巴细胞阴性分 选磁珠混合，通过MACS磁场阴性分选⑶25XD69-HLA-DR-的静息⑶4+T细胞；并以⑶4-FITC、 CD25-PE、CD69-APC和HLA-DR-PerCP-Cy5抗体进行标记分析细胞的纯化效率。
[0080] 5. 1. 2PCR检测HIV病毒pol基因的表达：
[0081] 将上述分离获得的⑶4+静息T细胞接种到12孔细胞培养板，每孔3mL含10U/mL IL-2和10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中加入5X 106细胞。培养孔中分别加入西达本 胺1. 0 μ mol/1和2. 0 μ mol/L进行处理，以5. 0 μ g/mL植物血凝素（PHA)或CD3单克隆抗 体处理孔作为阳性对照，以0. 5 μ mol/L伏立诺他作为对照药物，以未加药物处理孔为阴性 对照。作用6天后收集细胞培养上清，提取核酸。设计并合成HIV-1病毒基因组pol区的 特异性引物，进行常规PCR扩增，检测药物作用能否重激活CD4+静息T细胞中潜伏病毒的 表达。
[0082] 5. 1. 3酶联免疫吸附实验检测HIV病毒蛋白p24的表达：
[0083] 将上述细胞培养上清各取lmL，包括1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/L西达本胺处理组、 5. 0 μ g/mL PHA处理组、⑶3单克隆抗体处理组、0. 5 μ mol/L伏立诺他处理组以及未加药物 处理组。用酶联免疫吸附试剂盒检测病毒蛋白P24的含量，对PCR结果进行验证。
[0084] 5. 1. 4病毒载量分析系统检测西达本胺处理HIV潜伏感染的T细胞后病毒载量的 变化：
[0085] 收集1. 0 μ mol/L西达本胺和0· 5 μ mol/L伏立诺他处理组细胞，分离核酸，采用法 国生物梅里埃公司的NucliSENS EasyQ HIV-1病毒载量分析系统（病毒RNA的线性动力学 检测范围是50-3000000copies/mL)对CD4+静息T细胞药物作用后HIV RNA拷贝数进行检 测。以未加药物处理孔为阴性对照。NucliSens EasyQ HIV-1核酸扩增使用了针对野毒株 HIV-1RNA序列和人工合成内标物RNA序列（EasyQ HIV-lCalibrator)的特异引物，检测是 利用祀特异的分子信标进行的。NucliSens EasyQ HIV-1应用了两种不同的分子信标，一个 对于WT HIV-1扩增物是特异性的，另一个对于校准扩增物是特异性的。荧光信号的动态分 析揭示了 WT和校准RNA的转录率，据此就可以推出原始样本中HIV-1RNA的数量。这样，利 用HIV-1分析软件中应用数据还元运算法就可以定量病毒载量。
[0086] 5. 2实验结果：
[0087] 5. 2. 1MACS分离获得HIV患者的静息⑶4+T淋巴细胞
[0088] 采用德国美天旎公司的MACS磁场经过阴性分选从进行常规HAART治疗的HIV患 者外周血单个核细胞中分离得到⑶4+⑶25XD69-HLA-DR-静息T淋巴细胞，以⑶4-FITC、 ⑶25-PE、⑶69-APC和HLA-DR-PerCP-Cy5抗体进行标记分析细胞的纯化效率，结果显示纯 化效率>95%。由于⑶25和⑶69在分选前后含量都极低，图5列出了其中一次分选实验 中⑶4-FITC和HLA-DR-PerCP-Cy5标记的结果，A为分选前的HIV患者外周血单个核细胞， ⑶4+HLA-DIT细胞占19. 3 % ;B为分选出的⑶4+静息T淋巴细胞，⑶4+HLA-DIT细胞占95. 4 %。
[0089] 5. 2. 2西达本胺有效重激活HIV患者静息⑶4+T细胞中潜伏的HIV
[0090] HIV病毒pol基因的PCR检测结果如图5C所示，图中的1-6分别是：1:未处理 组，2:⑶3单克隆抗体处理组，3:5. 0μ g/mL PHA处理组，4:0. 5ymol/L伏立诺他处理组， 5:1. 0 μ mol/L西达本胺处理组和6:2. 0 μ mol/L西达本胺处理组。1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/ L西达本胺处理组以及PHA或⑶3单克隆抗体处理组均扩增出HIV病毒pol基因特异性条 带，说明静息⑶4+T细胞中潜伏的HIV被重新激活；而未加药物处理组和为伏立诺他处理组 结果为阴性，说明该组中的潜伏感染病毒未能有效激活。
[0091] 采用酶联免疫吸附实验检测HIV病毒蛋白p24的表达，1. 0 μ mol/L和2. 0 μ mol/L 西达本胺处理组以及PHA或⑶3单克隆抗体处理组均检测到病毒蛋白p24,分别为：1. 3pg/ mL、1. 3pg/mL、1. lpg/mL和4. 8pg/mL ;而未加药物处理组和为伏立诺他处理组未检测到p24 蛋白。结果与PCR结果一致。
[0092] HIV病毒载量检测进一步证实西达本胺能够有效重激活HIV患者静息⑶4+T细胞 中潜伏的HIV。常规HAART治疗的HIV患者外周血⑶4+静息T细胞中检测不到HIV RNA (拷 贝数〈5〇C〇pieS/mL) ; 1 μ mol/L西达本胺处理后，能够重激活⑶4+静息T细胞中潜伏的HIV 病毒，病毒拷贝数达到1161copies/mL ;而0. 5 μ mol/L伏立诺他处理未能有效激活潜伏病 毒活化。
[0093] 本实施例成功分离了 HIV患者外周血单个核细胞中的静息T淋巴细胞，证明西达 本胺等HDACi能够有效激活静息T淋巴细胞中的HIV潜伏病毒；即使对照药物伏立诺他不 能起作用的病例，西达本胺等苯酰胺类HDACi依然有较好地疗效。
【权利要求】
1. 苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备重激活持续性感染病毒药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂 为西达本胺、恩替诺特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂 为西达本胺。
4. 根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述引起人类持续性感染的病毒 可以为人类免疫缺陷性病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
5. -种药物组合物，所述组合物包括苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂和制药学上可 接受的载体。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制 剂为西达本胺、恩替诺特、莫西司他、AGK-2、AR-42或CI-994。
7. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述苯酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制 剂为西达本胺。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述西达本胺的有效剂量为 0.2-50 μ mol/L〇
9. 根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述西达本胺的有效剂量为 0· 5_5· 0 μ mol/L〇
10. 根据权利要求5-9中任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有 抗病毒制剂，所述抗病毒制剂可以为核苷（酸）类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制 齐U、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑制剂、受体拮抗剂和干扰素的一种或多种。
【文档编号】A61K31/4406GK104083763SQ201410340048
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】于群, 任素萍, 郐启源, 乔志新, 王艳冰, 王璇琳, 贺敏, 李伟静, 王钰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所