本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗人pd-1的单克隆抗体制剂。
背景技术：
：人程序性细胞死亡受体-1(pd-1)是一种有288个氨基酸的i型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(immunecheckpoint)之一(blanketal,2005,cancerimmunotherapy,54:307-314)。pd-1表达在已经激活的t淋巴细胞，它与配体pd-l1(程序性死亡受体-配体1，programmedcelldeath-ligand1)和pd-l2(程序性死亡受体-配体2，programmedcelldeath-ligand2)结合可以抑制t淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。pd-l2主要表达在巨噬细胞和树突状细胞，而pd-l1则广泛表达于b、t淋巴细胞及外周细胞如微血管上皮细胞，肺、肝、心等组织细胞中。大量研究表明，pd-1和pd-l1的相互作用不但是维持体内免疫系统平衡所必须，也是导致pd-l1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制和原因。通过阻断癌细胞对pd-1/pd-l1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进t细胞相关的肿瘤特异性细胞免疫反应，从而打开了一扇新的肿瘤治疗方法的大门--肿瘤免疫疗法。pd-1(由基因pdcd1编码)为与cd28和ctla-4有关的免疫球蛋白超家族成员。研究成果显示，当pd-1与其配体(pd-l1和/或pd-l2)结合时会负调节抗原受体信号转导。目前已弄清鼠pd-1结构以及小鼠pd-1与人pd-l1的共结晶结构(zhang，x.等，immunity20：337-347(2004)；lin等，proc.natl.acad.sci.usa105：3011-6(2008))。pd-1及类似的家族成员为i型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的ig可变型(v-型)结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。pd-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体itim(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和itsm(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。pd-1在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。肿瘤免疫疗法，即利用人体自身的免疫系统抵御癌症，是一种突破性的肿瘤治疗方法，但是肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受有效的免疫破坏，因此如何打破肿瘤微环境成为抗肿瘤研究的重点。现有研究成果已确定了pd-1在肿瘤微环境中的作用：pd-l1在许多小 鼠和人肿瘤中表达(并在大多数pd-l1阴性肿瘤细胞系中可由ifnγ诱导)，并被推定为介导肿瘤免疫逃避的重要靶点(iwaiy.等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.99：12293-12297(2002)；stromes.e.等，cancerres.，63：6501-6505(2003)。通过免疫组织化学评估活组织检查，已经在人的很多原发性肿瘤中发现pd-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或pd-l1在肿瘤细胞上的表达。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤等。由此可见，阻断pd-1/pd-l1的相互作用可以提高肿瘤特异性t细胞的免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此pd-1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。通常，蛋白质具有非常短的半寿期，并且在暴露于各种因素(如不适宜温度、水-气界面、高压、物理/机械应力、有机溶剂和微生物污染)之后经历变性(如聚集、解离和吸附在容器表面)。因此，变性蛋白失去内在的理化性质和生理活性。蛋白质的变性通常是不可逆的，因此蛋白质一旦变性，它们的天然性质可能不会恢复到初始状态。在生物制药行业中，使用重组dna技术制备的蛋白质在水性制剂中的长期储存通常是一项困难的任务。为了克服水性制剂中的蛋白质的稳定性问题，通过冻干(冷冻干燥)制备了更加稳定的治疗性蛋白产品。冻干产品通常伴随有用于复原的无菌水性介质。在复原之后，这些制剂典型地具有短的有效贮存寿命，即使在低温(例如，5℃)下保存时也是如此。由于冻干制剂存在来自复原程序的不便和错误的可能性，液体药物制剂是制备稳定、安全、有效的治疗用抗体药物的主要选择。然而，蛋白质治疗液体制剂长期存在的问题是聚集问题，其中蛋白质分子以物理方式粘在一起，导致形成可溶性高分子量聚集体等，在施用后可能在患者中引起不期望的免疫反应。另外，由于重复剂量对患者施用更为便利，需要开发单克隆抗体的多剂量制剂。然而，多剂量制剂需包含防腐剂以防护及其在多剂量停药期间免受微生物污染。已知抗微生物防腐剂与蛋白相互作用并导致例如聚集的稳定性问题。因此，在药物产品开发过程中，确定与制剂相容的防腐剂是主要的挑战。因此，有必要提供一种在冷藏下具有增强的稳定性并且在正常室温下具有至少中等的稳定性的抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂以在制造、储存和给 药期间保护抗体药物免于降解或聚集反应，从而避免来自复原程序的不便和错误的可能性。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定抗人pd-1的单克隆抗体的溶液制剂，其在制造、储存和给药期间是稳定的，并且适合以高浓度(例如用于皮下注射的多剂量施用)施用。因此，本发明的第一个目的在于提供一种稳定的抗人pd-1的单克隆抗体的多剂量液体制剂。本发明的第二个目的在于提供所述抗人pd-1单克隆抗体的液体制剂在制备药物中的应用。为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：本发明的第一个方面在于提供一种抗人pd-1的单克隆抗体的液体制剂，包括抗人pd-1单克隆抗体、表面活性剂、环糊精和防腐剂。其中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆或聚山梨酯20，优选为泊洛沙姆，最优选为泊洛沙姆188。其中，所述环糊精选自磺丁醚β环糊精、羟丙基β环糊精或羟丙基γ环糊精，优选为磺丁醚β环糊精。其中，所述防腐剂选自间甲酚、氯丁醇或苯甲醇，优选为苯甲醇。进一步的，所述的抗人pd-1的单克隆抗体的液体制剂还包括缓冲剂和稳定剂，优选地，缓冲剂可以是组氨酸、磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、tris等或其盐，更优选是组氨酸缓冲剂；所述稳定剂可选自糖(如单糖、双糖、多糖等)、氨基酸(如碱性氨基酸、酸性氨基酸、中性氨基酸等)、醇(如甘油、三羟甲基乙烷、季戊四醇、木糖醇、山梨醇等)、盐类(如钠盐、钾盐、氯盐、钙盐、磷盐等)、甲胺类(如甲胺盐酸盐、甲胺醋酸盐等)，优选是糖，更优选是蔗糖。进一步的，所述的抗人pd-1的单克隆抗体的多剂量液体制剂包括以下组分：(a)25-150mg/ml的抗人pd-1单克隆抗体，(b)10-50mm的组氨酸缓冲剂，(c)50-300mm的蔗糖，(d)1-20mg/ml的泊洛沙姆188，(e)10-200mg/ml的磺丁醚β环糊精，(f)0.1-10mg/ml的苯甲醇，和其中所述制剂的ph为5.0-6.0。更进一步的，所述的抗人pd-1的单克隆抗体的多剂量液体制剂包括以下组分：(a)100mg/ml的抗人pd-1单克隆抗体，(b)20mm的组氨酸缓冲剂，(c)250mm的蔗糖，(d)6-8mg/ml的泊洛沙姆188，(e)20-100mg/ml的磺丁醚β环糊精，(f)2-8mg/ml的苯甲醇，和其中所述制剂的ph为5.5。进一步的，所述的抗人pd-1的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：2所示，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：4所示。本发明的第二个方面在于所述的抗人pd-1的单克隆抗体的多剂量液体制剂的应用，用于制备治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥的药物。本发明所述的液体制剂较佳地为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物，更佳地为抗肿瘤药物、治疗自身免疫性疾病药物，优选地为抗肿瘤药物。本发明所述抗人pd-1的单克隆抗体的液体制剂可以单独使用或与抗pd-l1单克隆抗体或其它抗肿瘤药物的制剂联合使用。其中所述抗肿瘤药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌和/或头颈肿瘤中的一种或多种。本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。本发明中抗人pd-l1单克隆抗体的液体制剂在对包括人在内的动物给药时， 给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明的有益效果：本发明通过对表面活性剂、环糊精、防腐剂的优化，提供了一种抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂，其在制造、储存和给药期间是稳定的，在常温下保持至少一年的稳定，具有较低的聚集体，不需要经过冻干制剂的重新构建步骤，并且适合以高浓度(例如用于皮下施用)施用。本发明的稳定的抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。根据cn201511027510.9所述方法制备并获得包含seqidno：1和2限定的重链可变区和seqidno：3和4限定的轻链可变区的抗人pd-1单克隆抗体。以下实施例中，稳定性试验，相关生物学检验按照中国药典的规范进行。sds-page【聚集(非还原)和片段化(还原)】sds-page被用作一种分析技术，可以根据分子量从天然蛋白质中分离出游离的和高分子量的种类。由于在高浓度的大分子蛋白的情况下具有高的聚集倾向，非还原sds-page被用来评定共价聚集体。由于抗体结构轻重链之间，包括铰链区存在许多二硫键，在还原sds-page下检查蛋白质的片段化。se-hplc(聚集和片段化)用尺寸排阻色谱法分离蛋白质及其有关杂质(基于它们的尺寸)，上述技术对于检测单克隆抗体的聚集和片段化是有用的。差示扫描量热法(dsc)dsc是一种用来测定蛋白质的热力学稳定性的技术。单克隆抗体具有三个过渡区，tm1相对于fab部分，tm2相对于fc部分的ch2结构域，tm3相对于fc部分的ch3结构域(较高的tm决定了较高的稳定性)。除特别注明外，以下实施例中本发明所用试剂和原料均市售可得。任何本领域的普通技术人员将会理解的是，将被包括在组合物中的各种组分的组合可以以任何适当的顺序来完成，即，可以首先添加、在中间添加或在最后添加缓冲剂，并且也以可首先添加、在中间添加或在最后添加表面活性剂等。同样，本领域的普通技术人员将会理解的是，在某些组合中这些化学物质中的一些是不相容的，并且因此，它们可以容易地被具有相似性质但在有关混合物中是相容的不同的化学物质取代。实施例1表面活性剂对液体制剂稳定性的影响从非离子表面活性剂聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)和泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188或168)中筛选出在稳定性方面最适合的候选物。主要通过对比分析不同含量的聚山梨酯20和泊洛沙姆188的可溶性的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂在储存过程中的聚集情况，从而分析不同表面活性剂对制剂稳定性的影响。聚集体主要通过se-hplc方法评定。制剂配方及结果分别如表1和表2所示。表1、含不同表面活性剂的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂序号成分制剂配方1抗人pd-1单克隆抗体100mg/ml2组氨酸缓冲剂20mm3蔗糖250mm4表面活性剂参见表25ph5.5表2、含不同表面活性剂的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂的se-hplc结果由表2的结果可见，与含有聚山梨酯20表面活性剂的制剂相比，泊洛沙姆188具有更少的聚集体。更优选的，含有6-8mg/ml的泊洛沙姆188具有更好的稳定性。实施例2环糊精对液体制剂稳定性的影响环糊精(cd)是环状的寡糖，具有以α-(1,4)糖苷键连接的d-吡喃葡萄糖单位。最常见的天然存在的环糊精是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，分别由6、7和8个吡喃葡萄糖单位组成。环糊精已被用作低水溶性药物的助溶剂，并且由于抗体是高水溶性，因此添加环糊精有助于抑制抗体的聚集。研究不同的环糊精(磺丁醚β环糊精、羟丙基β环糊精、羟丙基γ环糊精)对抗人pd-1单克隆抗体液体制剂在储存过程中的稳定性的影响。聚集体主要通过se-hplc方法评定。制剂配方及结果分别如表3和表4所示。表3、含不同环糊精的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂表4、含不同环糊精的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂的se-hplc结果由表4的结果可见，在添加泊洛沙姆188的液体制剂的基础上，与羟丙基β环糊精和羟丙基γ环糊精相比，进一步添加磺丁醚β环糊精在测试温度下能够更有效地降低聚集体形成，而添加羟丙基β环糊精和羟丙基γ环糊精未显著改善聚集体形成。实施例3防腐剂对液体制剂稳定性的影响为了确定与制剂相容的防腐剂，不同的防腐剂(间甲酚、氯丁醇、苯甲醇)对抗人pd-1单克隆抗体液体制剂在储存过程中的稳定性的影响。聚集体主要通过se-hplc方法评定。制剂配方及结果分别如表5和表6所示。表5、含不同防腐剂的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂表6、含不同防腐剂的抗人pd-1单克隆抗体液体制剂由表6的结果可见，与含有间甲酚和氯丁醇的制剂相比，具有作为防腐剂的苯甲醇的组合物具有较少的聚集体增加。因此，苯甲醇被优选地作为适合的防腐剂。实施例4液体制剂的长期稳定性试验按照表7的配方制备抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂，然后在-20℃、4℃、25℃和40℃下储存1个月、3个月、6个月及12个月之后，通过se-hplc进行分析。结果如表8所示。表7、抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂序号成分浓度1抗人pd-1单克隆抗体100mg/ml2组氨酸缓冲剂20mm3蔗糖250mm4泊洛沙姆1888mg/ml5磺丁醚β环糊精50mg/ml6苯甲醇5mg/ml7ph5.5表8、抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂的se-hplc结果由表8的结果可见，本发明的抗人pd-1单克隆抗体的多剂量液体制剂稳定性较好，即使在常温下仍具有至少一年较好的稳定性(低于4％的聚集体)，能够 满足储存、运输、给药时的稳定性要求。另外，本发明的研究人员还对商品化的keytruda(pembrolizumab，默沙东)以及opdivo(nivolumab，百时美施贵宝)抗人pd-1单克隆抗体进行上述实验，实验结果与上述结果类似，均取得了很好的稳定效果。当前第1页12