一种药物组合物及其应用的制作方法

文档序号:12343461阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种药物组合物,其特征在于,所述组合物包括PD-1抗体和非特异性扩增激活T细胞。

2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述PD-1抗体的浓度为1-10mg/kg,优选为1-5mg/kg,进一步优选为2mg/kg;

优选地,所述非特异性扩增激活T细胞的数量为(3-12)×109个,优选为(6-10)×109个,进一步优选为5.83×109个。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物,其特征在于,所述非特异性扩增激活T细胞的制备方法包括如下步骤:

(1)抽取患者外周血,离心;

(2)离心后的上层血浆放入4℃冰箱中保存,用生理盐水稀释下层血细胞,稀释后的血细胞加至淋巴细胞细胞分离液上层,离心;

(3)离心后提取单个核细胞,用生理盐水洗涤,进行细胞计数;

(4)细胞计数后接种在包被过重组人纤粘连蛋白、CD3单抗和PBS的培养瓶内,加入完全培养液50-60mL,放入5%CO2培养箱中,37℃进行非特异性扩增激活T细胞的培养;

(5)隔日显微镜下观察,根据细胞状态和数量补充完全培养基;

(6)10-20d,优选14d后非特异性扩增激活T细胞成熟,用生理盐水洗涤,重悬后低速离心,弃上清,用含有20%白蛋白的生理盐水重悬细胞;

优选地,步骤(1)所述离心的条件为500-1000g,4℃离心10-20min,优选为800g、4℃离心15min;

优选地,步骤(2)所述的生理盐水和血细胞的体积比为(1-3):1,优选为1:1;

优选地,步骤(2)所述离心的条件为500-1000g,16-23℃离心10-20min,优选为800g、20℃离心17min;

优选地,步骤(3)所述洗涤的次数为1-5遍,优选为2-3遍;

优选地,步骤(4)所述的完全培养基为无血清培养基中加入800-1200IU/mL IL-2、800-1200IU/mL IFN-γ、100-200IU/mL庆大霉素、50-150IU/mL IL-1N和1-8%自体血浆,优选为1000IU/mL IL-2、1000IU/mL IFN-I、160IU/mL庆大霉素、100IU/mL IL-1α和5%自体血浆;

优选地,步骤(4)所述细胞计数后将细胞进行CD4和CD8磁珠分选,并将获得的CD4+T细胞和CD8+T细胞进行混合;

优选地,所述CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞数量比为1:1;

优选地,步骤(6)所述的洗涤后进行离心,离心的条件为100-500g,4℃离心5-16min,优选为300g、4℃离心8min。

4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物,其特征在于,所述非特异性扩增激活T细胞的制备方法包括如下步骤:

(1)抽取患者外周血50mL(肝素钠抗凝),分装在两个50mL的离心管内800G、4℃离心15min;

(2)离心后抽取上层血浆于50mL离心管中放于4℃冰箱中保存;

(3)将离心管中的血细胞与生理盐水1:1稀释,缓慢加至淋巴细胞细胞分离液上层,800G、20℃离心17min;

(4)离心后提取单个核细胞(即白膜层)置于50mL离心管内,加入生理盐水洗涤(300G、4℃离心8min),洗2遍;

(5)细胞计数后将细胞进行CD4和CD8磁珠分选,并将获得的CD4+T细胞和CD8+T细胞按细胞数量比1:1进行混合,细胞接种在包被过重组人纤粘连蛋白60μL/瓶、CD3单抗15μL/瓶、PBS 10mL/瓶的培养瓶内,加入完全培养液50-60mL,所述完全培养液为无血清培养液中加入IL-2为1000IU/mL,IFN-γ为1000IU/mL,庆大霉素为160IU/mL,IL-1α为50-150IU/mL,5%自体血浆,放入5%CO2培养箱中,37℃进行非特异性扩增激活T细胞的培养;

(6)隔日显微镜下观察,根据细胞状态和数量补充完全培养基;

(7)14d后非特异性扩增激活T细胞成熟,提前进行质控检测,合格后结合医嘱回收细胞,用生理盐水洗3遍(重悬后低速离心、弃上清),用含有20%白蛋白的生理盐水重悬细胞。

5.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为肺癌、乳腺癌、肾癌或肝癌中的任意一种或至少两种的组合,优选为肾癌;

优选地,所述抗肿瘤药物还包括药学上接受的辅料;

优选地,所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

7.一种检测如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物对肾癌细胞抑制作用的方法,其特征在于,包括如下步骤:

通过将如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物移植到患有肾癌的模型生物体内,检测模型生物体内肾癌肿瘤组织块来判断药物组合物对肾癌细胞的抑制作用。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述药物组合物转移的频率为2-5周一次,优选为3周一次;

优选地,所述模型生物为兔、鼠、猫、狗或猴中的任意一种模型生物,优选为免疫缺陷小鼠模型。

9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述检测的方式为量取肾癌肿瘤组织块大小、称量肾癌肿瘤组织块重量、荧光素酶-活体成像技术或流式细胞仪和免疫组化技术中的任意一种或至少两种的组合。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法在评估药物组合物对肾癌细胞抑制效果中的应用。

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