胚的EBx干细胞系（西格玛奥 德里奇公司（Sigma Aldrich))。宿主细胞群体还可以指代细胞组合或混合物，例如293细 胞（例如，293T细胞）或COS细胞（例如，C0S1、C0S7细胞）与MDCK或VERO或PERC. 6细 胞一起的组合。
[0067] 培养包括该一个或多个载体的宿主细胞群体并回收流感病毒。可以通过已知有益 于产生流感病毒的多种适当培养条件中的任一种培养宿主细胞。例如，培养可以在小于或 等于35°C的温度下，它可以在约32°C与35°C或约32°C与约34°C之间，或在约33°C，或在约 32。〇、33。〇、34。〇、35。〇、36。〇、37。〇或38。〇。
[0068] 典型地，使用温度调节器（例如恒温器），在受控的湿度和0)2下，在恒温下，将培 养物维持在系统（例如，细胞培养箱）中。可以在受控湿度和适于维持中性缓冲pH(例如， 在7. 0与7. 2之间的pH下）的CO2浓度下，将细胞群体培养在补充有血清（例如，10%胎 牛血清）的标准商业培养基（如杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco' s modified Eagle' s medium))中，或培养在无血清培养基中。任选地，该培养基包含用于阻止细菌生长的抗生 素（例如，青霉素、链霉素等）和/或另外的营养素，如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨 基酸、另外的促进有利的生长特征的补充剂，例如胰蛋白酶、巯基乙醇以及类似物。关 于在体外产生流感病毒的特别令人感兴趣的组织培养程序的另外的细节包括例如，在科恩 (Cohen)和谢弗曼（Shafferman)(编辑）的疫苗设计与生产中的新策略（Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)中的默腾（Merten)等人，1996 在用于制备疫苗 的细胞培养物中生产流感病毒（Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)中，将其以其全部内容结合在此。另外，通过常规实验法可容易地确 定适合于本发明的此类程序的变化。
[0069] 可以通过许多为本领域的普通技术人员已知且理解的方式中的任何方式从培养 的宿主细胞群体中回收流感病毒。例如，可以收获、澄清并浓缩粗培养基。技术人员回收流 感病毒所利用的常见技术包括过滤、超滤、用硫酸钡吸附以及洗脱和离心。例如，可以首先 通过在例如1000-2000xg下离心一段足够除去细胞碎片以及其他大的微粒物质的时间（例 如，10与30分钟之间）澄清来自培养物的粗培养基。可替代地，可以通过0. 8 ym醋酸纤维 素过滤器过滤培养基，以除去完整的细胞以及其他大的微粒物质。任选地，然后，将澄清的 培养基上清液例如在15, OOOxg下离心大约3-5小时，以沉淀流感病毒。将病毒沉淀物重悬 于适当的 pH 7. 4 的缓冲液（如 STE (0? OlM Tris-HCl ;0? 15M NaCl ;0? 0001M EDTA)或磷酸 盐缓冲盐水（PBS))中后，通过蔗糖（60% -12% )或酒石酸钾（50% -10% )密度梯度离心 来浓缩病毒。连续或分级梯度（例如，在四个12%步骤中的12%与60%之间的蔗糖梯度） 是适合的。可以将梯度在一定速度下离心并持续足够将病毒浓缩到用于回收的可见带中的 时间。可替代地，并且对于一些大规模商业应用而言，可以使用以连续方式操作的炜向离 心机转子从密度梯度中淘析病毒。足以引导普通技术人员从细胞培养物中制备流感病毒的 另外的细节提供于例如弗民格（Furminger)，疫苗生产（Vaccine Production)中；尼科尔 森（Nicholson)等人（编辑）流感教科书（Textbook of Influenza)第324-332中；科恩 (Cohen) &谢弗曼（Shafferman)(编辑）的疫苗设计与生产中的新策略（Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)第 141-151 页中的默腾（Merten)等人（1996) 在用于制备疫苗的细胞培养物中生产流感病毒（Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)以及美国专利号5, 690, 937中。希望的话，可以将回 收的病毒在作为稳定剂的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐（SPG)的存在下存储于-80°C下。
[0070] 提高甲塑流感病毒的复制能力的方法
[0071] 可以通过将对应于氨基酸残基位置125、127和209 (Hl编号）的一个或多个血球 凝集素氨基酸残基变为非天然存在的酸性氨基酸残基来提高甲型流感病毒在鸡胚中的复 制能力。该改变可以包括用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基，或用谷氨酸取代位置 127处的氨基酸残基，或用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基，或用天冬氨酸取代位置 125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基，或用天冬氨酸取代位置125 处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基，或用谷氨酸取代位置127处的 氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基，或用天冬氨酸取代位置125处的氨 基酸残基、用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残 基。
[0072] 还可以通过将对应于氨基酸残基位置222、241和369 (NI编号）的一个或多个神 经氨酸酶氨基酸残基变为非天然存在的氨基酸残基来提高甲型流感病毒在鸡胚中的复制 能力。该改变可以包括用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基，或用缬氨酸取代位置241 处的氨基酸残基，或用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或用天冬酰胺取代位置222 处的氨基酸残基并用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或用天冬酰胺取代位置222处 的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或用缬氨酸取代位置241处的 氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或用天冬酰胺取代位置222处的 氨基酸残基并用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基 酸残基。
[0073] 还可以通过改变对应于氨基酸残基位置125、127和209的一个或多个血球凝集素 氨基酸残基结合对应于氨基酸残基位置222、241和369的一个或多个神经氨酸酶氨基酸残 基来提高甲型流感病毒在鸡胚中的复制能力。该改变可以包括在血球凝集素多肽中用天冬 氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨 基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸 酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代 位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残 基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽 中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基， 或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中 用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或在 血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬 氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球 凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰 胺取代位置222处的氨基酸残基、用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取 代位置369处的氨基酸残基。
[0074] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并 在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用 谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的 氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸 酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代 位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残 基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置 209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用 缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的 氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺 取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的氨基酸 残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基、用缬氨酸取代位置 241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基。
[0075] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并 在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用 谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的 氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸 酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代 位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残 基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置 127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用 缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置127处的 氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺 取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置127处的氨基酸 残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基、用缬氨酸取代位置 241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基。
[0076] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基 并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222 处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷 氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基 酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代 位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残 基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置 127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用 天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125 处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬 酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基，或在血球凝 集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸 残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位 置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基 并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222 处的氨基酸残基、用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的 氨基酸残基。
[0077] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基 并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神 经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬 氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取 代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残 基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置 127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天 冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处 的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基 酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用天冬酰胺取 代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸 残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基 并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基并用缬氨酸取代位置241 处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷 氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸 酶多肽中用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残 基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置 127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天 冬酰胺取代位置222处的氨基酸残基、用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰 胺取代位置369处的氨基酸残基。
[0078] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基 并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中 用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处 的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨 酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸 取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多 肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位 置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用 天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代位置127处 的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰 胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨 基酸残基、用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残 基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基。
[0079] 该改变可以包括在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基 并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代氨基酸残基222、用缬氨酸取代位置241处的氨基 酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用谷氨酸取代 位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代氨基酸残基222、用缬氨 酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝 集素多肽中用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取 代氨基酸残基222、用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处 的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨 酸取代位置127处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代氨基酸残基222、 用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在 血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位置125处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处 的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代氨基酸残基222、用缬氨酸取代位置 241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中 用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209处的氨基酸残基并在神经 氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代位置222处的氨基酸、用缬氨酸取代位置241处的氨基酸残 基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基，或在血球凝集素多肽中用天冬氨酸取代位 置125处的氨基酸残基、用谷氨酸取代位置127处的氨基酸残基并用谷氨酸取代位置209 处的氨基酸残基并在神经氨酸酶多肽中用天冬酰胺取代氨基酸残基222、用缬氨酸取代位 置241处的氨基酸残基并用天冬酰胺取代位置369处的氨基酸残基。
[0080] 由血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中的一个或多个改变引起的提高的复制能 力产生了一种相对于亲本流感病毒（例如，在血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中引入一 个或多个改变之前的流感病毒）在鸡胚卵中生长至更大滴度的流感病毒。当与亲本流感病 毒相比时，血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中的一个或多个改变可以将复制能力提高至 少约10%、或至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、 或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或至少约100%、或至少约200%、或至少约 300%、或至少约400%、或至少约500%。
[0081] 血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中的一个或多个改变可以将该流感病毒的复 制能力相对于亲本流感病毒提高至少2倍，或可以将复制能力相对于亲本流感病毒提高至 少4倍或至少8倍、至少10倍，或相对于亲本流感病毒提高至少100倍。
[0082] 血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中的一个或多个改变可以将该流感病毒的复 制能力提高至在鸡胚卵中的滴度为至少约7. 51og1(lFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴度为至少约 81og1(lFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴度为至少约8. IlogiciFFUAil、或在鸡胚卵中的滴度为至少 约8. 21og1QFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴度为至少约8. 31og1QFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴度为 至少约8. 41og1(lFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴度为至少约8. 51og1(lFFU/ml、或在鸡胚卵中的滴 度为至少约91og1(lFFU/ml。
[0083] 可以通过用如在此描述的非天然存在的氨基酸残基取代一个或多个天然存在的 氨基酸残基来改变对应于氨基酸残基位置125、127和209 (HI编号）的一个或多个血球 凝集素氨基酸残基和/或对应于氨基酸残基位置222、241和369 (NI编号）的一个或多个 神经氨酸酶氨基酸残基。可以通过本领域的普通技术人员熟知的任何操纵技术或一套操 纵技术完成一个或多个氨基酸取代。可以被包括在这样的一种或多种操纵中的程序的详 细方案可以是：扩增、克隆、诱变、转化等，如描述于例如奥苏贝尔（Ausubel)等人当代分 子生物学实验手册（Current Protocols in Molecular Biology)(补充至 2000 年）约 翰威利父子公司，纽约（"奥苏贝尔；萨姆布鲁克（Sambrook)等人分子克隆：实验手册 (Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第 2 版），第 1-3 卷，冷泉港实验室，冷泉港， 纽约，1989( "萨姆布鲁克"），以及贝格尔（Berger)和基梅尔（Kimmel)分子克隆技术指南 (Guide to Molecular Cloning Techniques)，酶学方法（Methods in Enzymology)第 152 卷学术出版公司（Academic Press，Inc.)，圣地亚哥，加州（"贝格尔"）。
[0084] 例如，可以通过例如定点诱变完成病毒血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中 的选定氨基酸残基的取代。可以通过如描述于例如奥苏贝尔（Ausubel)、萨姆布鲁克 (Sambrook)和贝格尔（Berger)，见上文中的熟知方法进行定点诱变。多种用于进行定 点诱变的试剂盒也是可商购的，例如变色龙定点诱变试剂盒（Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene公司，拉荷亚），并且可以根据厂商的说明书使用，以向编码 甲型流感病毒血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽的基因组区段中引入例如一个或多个氨 基酸取代。
[0085] 可以用于在血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中引入氨基酸取代的其他操纵技 术可以包括体外扩增，如聚合酶链式反应（PCR)、连接酶链式反应（LCR)、Q复制酶扩增以 及其他RNA聚合酶介导的技术（例如，NASBA)，发现于穆利斯（Mullis)等人（1987)美 国专利号 4, 683, 202 ;PCR 方案：方法与应用指南（PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)(英尼斯（Innis)等人编辑）学术出版公司圣地亚哥，加州（1990) ("英尼斯"）；阿恩海姆（Arnheim)和莱文森（Levinson) (1990)C&EN36;NIH研宄杂志 (The Journal Of NIH Research) 19913:81;郭（Kwoh)等人 1989 美国国家科学院院刊 (Proc Natl Acad Sci USA)86，1173;瓜特利（Guatelli)等人 1990 美国国家科学院院 刊87:1874;罗梅尔（Lomell)等人1989临床化学杂志（J Clin Chem)35:1826;兰德格 伦（Landegren)等人 1988 科学（Science) 241:1077 ;范布伦特（Van Brunt) 1990 生物技 术（13;[(^6(3]111〇1〇85〇8:291;吴（而）和华莱士〇^113〇6) 1989 基因（66116)4:560;巴林杰 (Barringer)等人 1990 基因 89:117,以及苏克纳南（Sooknanan)和马利克（Malek) 1995 生物技术13:563中。可用于克隆核酸的另外的方法包括华莱士（Wallace)等人，美国专 利号5, 426, 039中。通过PCR扩增大的核酸的改进方法概述于郑（