L 6测定方法与测定结果
[0055] 取上述标准品溶液和供试品溶液各20ul注入色谱柱，用外标法以峰面积计算4种 有机酸的含量。测定结果如下：
[0056] 表1-1尿多酸肽提取物中有机酸测定结果
[0058] 结果表明供试品中各有机酸的保留时间与对照品基本一致，可证明本品含以上 四种有机酸。根据峰面积分析尿多酸肽粗品供试品中四种有机酸的含量分别是：马尿 酸1. 01mg/ml ;苯乙酰谷氨酰胺1. 43mg/ml ;4_羟基苯乙酸0· 12mg/ml ;5_羟基吲噪乙酸 0. 04mg/ml ;即lmg尿多酸肽粗品中含马尿酸0. 126mg、苯乙酰谷氨酰胺0. 179mg、4-羟基苯 乙酸15 μ g、5-羟基吲哚乙酸5 μ g。四种有机酸的总质量在尿多酸肽中占的百分比为36%。
[0059] 2. 2电喷雾法质谱仪测定肽组分及部分肽序列测定
[0060] 检测条件：正离子检测方式，毛细管电压3000V，Cone电压50V，Collision电压 30V，Mep检测电压2000V。肽序列分析软件为Micromass公司的Biolynx。温度：22°C ;检 测仪器名称与型号：Q-T0F2ESI-MS/MS (Micromass) 〇
[0061] 2. 2.1分析方法：
[0062] (1)样品预处理：称取尿多酸肽粗品约10.0 mg于10ml具塞刻度试管中，加入 5. 0ml三氯甲烷，充分振荡并超生提取3min，静置10min，用洁净的吸管将三氯甲烷小心吸 出；加入5ml石油醚，同样超声后吸除；再加入5. 0ml无水乙醇，同上面的步骤重复三次，残 余物自然瞭干待用（约40min)。
[0063] (2)肽成分的寻找与识别：上述处理的样品溶解于5mll%甲酸去离子水中，离心 后取lul进行毛细管高效液相色谱纳升电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱自动化分析。
[0064] (3)部分肽成分的序列测定：上述处理过的样品溶解于5mll%甲酸去离子水中， 离心后取lul进行纳升电喷雾-四级杆飞行时间串联质谱分析，选择1-2个主峰进行序列 测定。
[0065] 2· 2· 2 结果
[0066] (1)离子色谱图显示I、II、III三个区域保留时间分别为：14~19min，30~ 45min，45 ~55min〇
[0067] (2) I区的总质谱图结果表明约含20多个肽，相对含量较高者分子离子峰分别为 1218. 69,1240. 67,1251. 69,1322. 74,1452. 81 (分子量=分子离子峰-1. 0078)。
[0068] (3)11区的总质谱图未发现明显的离子峰，用专门的软件MaxEnt3转换后的图谱 显示转换前后质谱图一致，因此可以看出该区的肽组分很少。
[0069] (4)111区的总质谱图表明与II区一样，肽组分很少，几乎没有。
[0070] 2. 2. 3选择两个强度较大的粒子进行串联质谱分析
[0071] m/z626. 36的序列测定结果序列为：AVEGPSSALGPLCGP，单同位素质量 1250. 7043Da，理论值为 1250. 6506Da，偏差为(λ 05Da ;
[0072] m/z609. 84的序列测定结果为：GPSTPGPPPNGGA，单同位素质量1217. 6644Da，理论 值为 1217. 6040Da，偏差为 0· 06Da。
[0073] 实验例1尿多酸肽诱导人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞（hHSF)凋亡实验
[0074] 1、人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的制备
[0075] 取16-30岁病人皮肤增生性瘢痕，在无菌条件下去除表皮和皮下组织，生理盐水 反复冲洗后剪切成〇. 5-1. 0mm3的组织块，适量FBS (小牛血清）反复洗涤组织块，之后将其 接种于一次性培养瓶壁上，组织块间距控制在〇. 3-0. 5mm，加入5ml含20% FBS的DMEM培 养液（含青霉素 l〇〇U/ml、链霉素100U/ml)，于37°C，5 % C02细胞培养箱内培养，每周换液2 次，待原代细胞生长基本融合成片时，吸取培养液，PBS漂洗2次后加入0. 25%胰蛋白酶消 化lmin，待观察到细胞间隙增大，且显微镜下见胞质回缩时，吸弃胰酶，加入含血清的DMEM 培养基终止消化，轻轻吹打细胞使呈细胞悬液，转移至15ml离心管中，于1000r/min离心 3min，弃上清再加入含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，按1 : 3比例传代，使用第3-6代 细胞进行以下实验。
[0076] 2、尿多酸肽对人瘢痕成纤维细胞活力的影响
[0077] MTT(3_(4, 5)-dimethylthiahiazo(_2_yl)_3, 5-di-phenytetrazoliumromide)比 色法是检测细胞存活和生长常用的方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，而死细胞却不能，DMS0(二甲基亚砜）可以溶解细胞中的甲 瓒，而且在490nm处有最大吸收峰，该吸收值间接反映了细胞活力。
[0078] 本发明比较了积雪草戒（Asiaticoside，C4SH7S0 19，积雪苷霜的主要成分，购自 Sigma-Aldrich，货号：43191)、姜黄素（Curcumin，购自 Sigma-Aldrich，货号：08511)、维甲 酸（1^1:;[110;[11，0!。!12802，购自3丨81]^-八1(11'；[(311，货号：1?2625)、尿囊素（八113111:0;[11，0 4!161'1403复 方肝素钠尿囊素凝胶的主要成分，购自Sigma-Aldrich，货号：93791)及尿多酸肽（CDA-II) (按本发明实施例1方法制得）这四种原料药对人瘢痕成纤维细胞活力的影响。细胞活力 测定方法如下：
[0079] 将对数生长期的人瘢痕成纤维细胞用10 % FBS的DMEM培养液制成5 X 104个/ml 的细胞悬液，以每孔200ul分别接种于3个96孔培养板，边缘孔用杜氏磷酸缓冲液（DPBS) 填充；37°C，5% C02培养箱中培养24hr。将以上药物按照表1-1中所示配制成不同浓度 的稀释液。其中姜黄素与维甲酸不溶于水，因此先用DMSO分别配置lOmg/ml母液，之后用 DMEM培养基逐级稀释到表1-1中所示的浓度。24hr后弃上清培养液，分别加入200ul不同 浓度的药物，对照组加入200ul含10% FBS的DMEM培养液，每种药物的每个浓度做4个复 孔，于37°C，5% C02培养箱中培养48hr后加入20ul MTT(5mg/ml，即0. 5% MTT)，继续培养 4hr，吸弃培养液，每孔加150ul DMS0终止反应，振荡15min后于酶联免疫分析仪上测定吸 亮度Α4Μηηι值，分别测的不同浓度尿多酸肽在不同时间的细胞增殖抑制率（细胞增殖抑制率 =(1-实验组平均吸亮度值/对照组平均吸亮度值）X 100% )，以药物浓度为横坐标，细胞 增殖抑制率为纵坐标，绘制药物剂量-效应曲线，结果如图1。此后选用细胞增殖率最高时 对应的药物浓度重复做三批细胞实验，统计分析三批实验的平均抑制率，将实验组与对照 组采用T-test统计方法分析差异显著性，结果如图2中所示。
[0080] 表1-1不同药物配制的浓度表
[0082] 由图1可见积雪草甙在其浓度为64mg/ml时对人瘢痕纤维细胞增殖抑制率达到最 大值75. 69 %，姜黄素在浓度为0. 016mg/ml时细胞增殖抑制率达到最大值52. 99 %，维甲酸 在浓度为〇. 32mg/ml时细胞增值抑制率达到最大值67. 93 %，而尿囊素在浓度为0. 16mg/ml 时细胞增殖抑制率达到最大值77. 46 %，而尿多酸肽浓度为6. 4mg/ml时对人瘢痕成纤维细 胞的抑制率最大，最大抑制率为88. 45%，通过T检验分析尿多酸肽对细胞增殖的抑制率显 著高于其他四种药物（**P < 〇. 01)，对人瘢痕成纤维细胞的抑制效能最高。
[0083] 表1-2MTT法检测不同药物对瘢痕成纤维细胞的作用
[0085] 试验例2、尿多酸肽对兔耳增生性瘢痕的抑制实验
[0086] 1、瘢痕动物模型的建立
[0087] 取3-4个月大小的日本长耳白兔，雌雄均可，体重2. 2-2. 6kg，氯胺酮（15mg/kg)耳 缘静脉注射麻醉，将兔子俯卧固定于操作台上，每测兔儿腹侧面均手术切除直径为l〇mm的 全层皮肤，刮除软骨膜，两侧耳共5处，各创面间隔15mm以上，创面暴露，待创面上皮化20d 后，瘢痕增生块形成。
[0088] 2、尿多酸肽软膏制备方法
[0089] 2. 1软膏基质制备：
[0090] 软膏基质成分冰片、薄荷脑、樟脑、麝香草酚均研磨成细分，并过120目筛，根据需 要本动物实验需要用到的基质总量为：基质的质量百分比52% (0. 5%冰片+48%凡士林 +2 %薄荷脑+1 %樟脑+0. 5 %麝香草酸）*180个创面*每个瘢痕涂抹软膏量50mg = 4680mg， 共制备5. 2g上述基质。称取凡士林4. 8g，加热至50~60°C，使其融成稠膏，恒温放置备用。 分别称取已研磨并过筛的细粉：冰片50mg、薄荷脑200mg、樟脑100mg、麝香草酸50mg，将上 述细粉混合