均匀，边搅拌边加入凡士林液态稠膏中，直至均匀，恒温保持稠膏态备用。
[0091] 2. 2不同浓度的尿多酸肽软膏的制备：
[0092] 按照表2-2不同药物软膏原料成分质量百分比表，可知尿多酸肽软膏测试组共 设7个不同浓度，每个浓度的尿多酸肽软膏平行涂抹5个创面，每个创面需涂抹软膏基 质50mg，故计算可得每种浓度的尿多酸肽软膏需制备：5个平行创面*每个瘢痕涂抹软膏 量50mg = 250mg，防止软膏制备和使用过程中的损耗，每种浓度的尿多酸肽软膏共制备 300mg〇
[0093] 称取 3mg、6mg、12mg、24mg、48mg、96mg、144mg 尿多酸肽细粉，分别加至 141mg、 138mg、132mg、120mg、96mg、48mg、0mg丙二醇中，搅勾得尿多酸肽丙二醇溶液。将上述溶液， 分别加入7份已制备好的156mg的2. 1基质中，充分搅匀冷凝制得尿多酸肽软膏，将以上不 同浓度的尿多酸肽软膏制剂，用铝箱袋包装密封，再辐照灭菌，于4°C保存待用。
[0094] 2. 3不同浓度阳性对照药软膏的制备：
[0095] 另外四种含积雪草甙、姜黄素、维甲酸及尿囊素四种药物软膏中个药物所含质量 百分比如表2-2中所示，制备方法同2. 2。
[0096] 2. 4空白对照软膏的制备：
[0097] 空白对照组的软膏：称取144mg丙二醇与156mg制备好的2. 1基质充分混合均匀 冷凝即可。
[0098] 表2-1不同药物软膏原料成分质量百分比表
[0100] 表2-2不同药物软膏制剂处方表
[0102] 3、尿多酸肽对兔耳瘢痕模型动物的瘢痕影响的研究
[0103] 本实验分为6组：（1)空白对照组；（2)阳性对照组（2-1 :姜黄素，2-2 :维甲酸， 2-3 :积雪草甙，2-4 :尿囊素；(3)尿多酸肽组。
[0104] 36只兔子，每只兔子设有5个创面，共计180个创面。每种软膏阳性对照药物组， 均有7个不同软膏制剂处方，每种软膏制剂处方平行涂抹5个创面，即每种软膏阳性对照药 物组需要7*5 = 35个创面。尿多酸肽组以此类推也需要35个创面。空白软膏基质对照组 (不加任何原料，只加基质，各基质质量百分比如下，丙二醇：冰片：凡士林：薄荷脑：樟 脑：麝香草粉=48 : 0.5 : 48 : 2 : 1 : 0.5)只有1个制剂处方，平行涂抹5个创面。 所以整个兔子实验需要：4种阳性对照软膏*7个制剂处方*5个平行创面+1个尿多酸肽测 试药物软膏*7个制剂处方*5个平行创面+1个空白软膏*1个制剂处方*5个创面=180 个创面。在兔耳瘢痕形成的位置外涂相应的药物软膏，并轻柔直到药物均匀；每天一次，每 处瘢痕约50mg，连续处理28天，第28天后检测以下指标：
[0105] 瘢痕增生观察：4周停药后24hr内切取增生块，称取增生块重量，并计算每组增生 块生长抑制率，计算公式如下：
[0106] 抑制率=(1-用药组平均瘢痕重量/空白对照组平均瘢痕重量）X 100%
[0107] 结果如图3所示，结果表明阳性对照组中2-1到2-4四种原料质量百分比依 次为32 %、0. 16 %、3. 2 %、1. 6 %时对兔耳瘢痕增生块的抑制率达到最大，最大值分别为 76. 68%、50. 46、56. 78、68. 93% ;尿多酸肽原料质量百分比为16%时，对兔耳的瘢痕增生块 抑制率达到最大，抑制率为89. 28%。通过T检验分析，如图4所示，表明尿多酸肽对瘢痕增 生块抑制率的Emax(最大效能）显著高于其他四种阳性对照药物的Emax(**P < 0. 01)。
[0108] ②瘢痕中胶原纤维面密度：将切取的每种药物对兔耳瘢痕增生块抑制率最大的瘢 痕经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后制成约4 μ m的切片，采用VG染色法染色，即常规脱蜡后 用铁苏木精混合液染色5min，盐酸酒精分化，氨水反蓝，VG液1 %酸性复红2滴，饱和苦味 酸8滴染色5min，以上每步之间均使用蒸馏水洗lmin，之后95 %酒精分化并脱水，二甲苯透 明，中性树胶封片。在瘢痕切片中央及侧部各随机选取5个视野在显微镜下拍照，胶原纤维 经VG染色后为红色，利用计算机图像分析系统计算胶原纤维的平均面密度。
[0109] ③瘢痕I、III型胶原比例：用药28d后，同②中一样，取每种药物对兔耳瘢痕增生 块抑制率最大的瘢痕制成切片，经苦味酸-天狼猩红染色，即常规脱蜡后入天青石蓝液染 5min，蒸馏水洗三次，之后用天狼猩红饱和苦味酸染液30min，无水乙醇分化与脱水，二甲苯 透明，中性树胶封片，之后于偏光显微镜下观察并保存图像，I型胶原纤维显示为红色或黄 色纤维，III型胶原显示为绿色网状纤维，利用计算机图像分析系统计算I、III型胶原所占 面积百分数。
[0110] 以上②~③检测指标中各瘢痕组织块测得的胶原纤维面密度和I、III型胶原比 例结果如下表2-3所示，结果表明尿多酸肽使得兔耳瘢痕中成纤维密度以及I型胶原与III 型胶原比例较其他几种药物显著下降，疗效最突出。
[0111] 表2-3胶原纤维面密度和I、III型胶原比例测试结果
[0114] 综上所述，本发明结果表明尿多酸肽能显著抑制皮肤瘢痕成纤维细胞的增殖，减 少瘢痕的指数，因而可以用于制备治疗瘢痕的药物。
【主权项】
1. 一种尿多酸肽制备治疗瘢痕的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿多酸肽为含有尿多酸肽的制剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为外用制剂，所述外用制剂为凝 胶剂、软膏剂、喷雾剂或透皮贴剂。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述外用制剂中含尿多酸肽的量以质量 计为 1% -48%。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿多酸肽包括马尿酸、苯乙酰谷氨酰 胺、4-羟基苯乙酸和5-羟基吲哚乙酸，其中所述马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、4-羟基苯乙酸和 5-羟基吲哚乙酸的量占总质量的百分比为28. 5%~37. 75%。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述尿多酸肽中每Img尿多酸肽含 0? IOmg~0? 15mg马尿酸、0? 15mg~0? 20mg苯乙酰谷氨酰胺、10 y g~20 y g 4-羟基苯乙 酸、5-羟基吲哚乙酸2. 5 y g~7. 5 y g。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述尿多酸肽采用如下方法制备： 1) 取新鲜尿液，加入HCl调节pH值，进行超滤，收集分子量低于IOkD的滤液；然后将 滤液以I. 51/min流速上XAD-8硅胶柱，之后先用20L蒸馏水以31/min吸附柱，再用15L乙 醇以I. 01/min的流速加入XAD-8柱中，收集有色部分的洗脱液；真空干燥处理，缓慢升温至 50°C，直到溶剂全部蒸发；此后进行冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物的干品； 2) 用蒸馏水溶解干品至浓度为40mg/ml，用NaOH调节pH值，即得尿多酸肽粗品溶液； 将粗品溶液置4°C低温条件120hr，取上清液进行微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤，除去 热源和病毒。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中的pH值为1. 5-3. 0。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中的pH值为6. 5-7. 5。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述尿多酸肽采用如下方法制备： 1) 取新鲜尿液，加入lmol/1 HCl调节其pH至2. 0,用尼龙布过滤收集尿液，超滤设备进 行超滤，在超滤设备中加入去离子水，洗泡超滤膜，将收集的尿液倒入加料桶中，开启纳滤， 收集分子量低于IOkD的滤液；取XAD-8硅胶，用乙醇浸泡，装入袋中放置于塑桶内，制成吸 附柱，用95%乙醇冲洗柱子，之后用同样体积的去离子水洗涤吸附柱；然后将过滤后的尿 液以I. 51/min的流速加入柱中，加完后先用蒸馏水以31/min的流速加入吸附柱，再用95% 乙醇以I. 01/min的流速加入XAD-8柱中，收集有色部分洗脱液；经真空干燥处理，缓慢升温 并控制料液温度为50°C至溶剂全部蒸发；冷冻干燥，得到尿多酸肽组合物的干品； 2) 用蒸馏水溶解干燥残留物，使其浓度为40mg/ml，用2mol/l NaOH调节尿多酸肽粗品 的pH值到7. 4后，于4°C低温条件放置120hr，取上清液，依次用I y m和0. 45 y m的微孔滤 膜过滤，然后用10000分子量的超滤膜超滤，除去热源，再经Ultipor VF? DV50过滤器除病 毒，即得。
【专利摘要】本发明涉及医药领域，具体涉及一种尿多酸肽的应用，本发明提供了尿多酸肽制备治疗皮肤瘢痕的药物中的应用，所述尿多酸肽能够诱导成纤维细胞凋亡，抑制其增殖，且抑制程度随尿多酸肽浓度的增加而增大，实验显示，尿多酸肽对于成纤维细胞增生的抑制率高达88.45％，能够有效地治疗皮肤瘢痕。
【IPC分类】A61K31/192, A61K35/22, A61K31/405, A61K31/198, A61K38/04, A61P17/02
【公开号】CN105233248
【申请号】CN201510562475
【发明人】陶俊, 张宝霞
【申请人】泰凌(中国)投资有限公司, 周明涛
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年9月8日