igma公司。化合物（I) 为自制，HPLC归一化纯度大于98% dDMEM/F12培养基(进口分装购于北京赛默飞世尔生物化 学制品有限公司。Newbom Calf Serum购于Beijing Solarbio Science&Technology Co.， LtcLMTT购于美国Amresco公司。凯基AnnexinV-FITC细胞调亡检测试剂盒购于南京凯基生 物技术有限公司。多聚甲醒购于中国医药集团化学试剂有限公司。Bcl-2多克隆抗体购于武 汉博±德生物技术有限公司。Bax多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。切t-c多 克隆抗体购于武汉博±德生物技术有限公司。羊抗兔IgG/FITC购于北京博奥森生物技术有 限公司。羊抗鼠 IgG/化+L)购于江苏碧云天生物公司。正常山羊血清购于武汉博±德生物技 术有限公司。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博±德生物工程有限公司。DAB显色试剂盒购于 武汉博±德生物技术有限公司。
[0030]电子分析天平(FA2004型，上海雷磁精密科学仪器公司），水浴锅化H ? SI1-4型，北 京医疗器械厂），酶标仪化Lx-800型，美国Bio-Tek),流式细胞仪化PIC化-M化型，美国 Beckman Couiter公司），高速冷冻离屯、机（3K30型，美国Sigma公司，二氧化碳培养箱（C0-150型，美国NBS有限公司），化YMPUS巧光显微镜(BX41型，带DP70摄像系统，日本Olympus公 司产品）。
[00川二、试验方法
[0032] 1、A执-40解育
[0033] A&-40用去离子水配制成1000皿ol/L储存液并分装，放置于冰箱-20°C储存，临用 用前一周取出在37°C培养箱解育7d，使之聚集老化。
[0034] 2、细胞的培养
[0035] PC12细胞株用含10%胎牛血清、10011/而青霉素、1001]/1吐链霉素的0161/。12培养 基在玻璃培养瓶中培养，0)2细胞培养箱的培养条件为37 °C，5 % C〇2浓度，饱和湿度，待细胞 长至80%丰度后用0.25%的膜酶消化传代1次(约2-3d)，倒置显微镜观察细胞生长状况，实 验时取对数生长期细胞进行实验。进行MTT实验前将细胞接种到96孔培养板用无血清培养 基培养;流式细胞仪检测前将细胞接种至6孔培养板用无血清培养既培养;免疫组化实验均 用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。
[0036] 3、细胞给药处理及分组
[0037] 细胞共分为五组，无血清培养基接种Mh后进行药物干预：①正常对照组：正常 PC12细胞;②模型组:25皿ol/L A&-4();③化合物（I)低剂量组:25皿ol/L A&-4()+50mg/L化合 物（I);④化合物（I)中剂量组：2化mo 1/L A&-40+1 OOmg/L化合物（I);⑤化合物（I)高剂量 组:25皿ol/LA&-4Q+200mg/L化合物（I)。药物处理24h后进行检测各项指标。
[003引 4、MTT检测各组细胞活力
[0039] 取对数生长期的细胞，膜酶消化后Wl X IO5个/mL的细胞密度，每孔10化L接种于 96孔板中无血清培养2地，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，2地后， 每孔加入5mg/mL的MTT溶液20化继续在C〇2细胞培养箱中解育地，然后取出96孔培养板，弃 去上清液，每孔加入15化L的DMS0,放在摇床上振荡lOmin，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪 在490nm波长处检测各孔的吸光值。W只加培养液的孔为调零参照，细胞活力用百分比表 达，视对照组的细胞活性为100%。结果计算：细胞存活率=(实验组OD值-空白对照组OD 值)/(对照组OD值-空白对照组OD值）X 100%。
[0040] 5、统计分析
[0041] 采用SPSS17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数 ±标准差（表示，组间采用LSD比较，P<0.05为具有显著性差异，P<0.Ol为极其显著性 差异，图表由Excel 2003绘制。
[0042] S、结果及结论
[0043] MTT测试结果显示，与正常组细胞比较，模型组细胞活性明显降低(P<0.01)，化合 物（I)干预后细胞活性有所提高，其中高、中剂量组细胞活性的升高具有统计学意义（P< O. Ol，P<0.05)，低剂量组细胞活性改变不大(P〉0.05)。见表1 (与模型组比较冲<0.05，*冲< 0.01)。
[0044] 表1 MTT法化合物（I)对A执-40诱导PC12细胞活性的影响（:^：s:，n = 6)
[0046] 结论，本研究证实A&-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量调亡，细胞活性下降， 化合物（I)干预后调亡情况得到改善。因此，该化合物（I)具备在治疗保护神经类药物上具 有医药用途和前景。
[0047] 实施例3
[0048] 应用时，药物组合物中片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有 机酸如酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按其与 赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0049] 实施例4
[0050] 应用时，药物组合物中口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用 有机酸如酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常 规口服液制法制成口服液。
[0化1] 实施例5
[0052]应用时，药物组合物中胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)， W及利用有机酸如酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成 的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0化3] 实施例6
[0054]应用时，药物组合物中注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利用 有机酸如酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，按常 规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[0化5] 实施例7
[0056] 应用时，药物组合物中无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，W及利 用有机酸如酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或憐酸制成的盐，将 其溶于无菌注射用水中，揽拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安飯中，低溫 冷冻干燥后无菌烙封得粉针剂。
[0057] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种黄酮类化合物（I)在制备神经保护的药物中的应用，其特征在于:具有下述结构 式的化合物(I)，2. 权利要求1所述的应用，其特征在于:所述黄酮类化合物（I)从马鞭草中分离获得，具 体分离步骤： a、 将马鞭草的干燥地上部分粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无 醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯 萃取物和正丁醇萃取物； b、 步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱10个柱体积，再用75% 乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏； c、 步骤b中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、10:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分； d、 步骤c中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； e、 步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇 水溶液等度洗脱，收集9~13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为 75%。5. -种药物组合物在制备神经保护的药物中的应用，所述药物组合物含有治疗有效量 的权利要求1所述的黄酮类化合物(I)和药学上可接受的载体。
【专利摘要】本发明属于药物领域，具体涉及从马鞭草的干燥地上部分中分离得到的一种新的黄酮类化合物的医药用途。一种黄酮类化合物在制备神经保护的药物中的应用，该化合物为首次报道，可以从马鞭草的干燥地上部分中提取、分离纯化得到，纯度高。体外试验证明Aβ1-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量凋亡，细胞活性下降，化合物(Ⅰ)干预后凋亡情况得到改善，可以进一步研究开发成神经保护的药物。
【IPC分类】A61P25/00, A61K31/357
【公开号】CN105663118
【申请号】CN201610105713
【发明人】王赛波
【申请人】温州统益生物医药科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月26日