一种抗人Tim‑3的单克隆抗体的抗原结合部分的制作方法与工艺

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一种抗人Tim‑3的单克隆抗体的抗原结合部分的制作方法与工艺
一种抗人Tim-3的单克隆抗体的抗原结合部分技术领域本发明属于生物工程技术领域,涉及抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分。本发明还涉及上述单克隆抗体或其抗原结合部分的用途,包括制备人Tim-3蛋白免疫检测工具、制备治疗与Tim-3异常表达相关的疾病的药物制剂。

背景技术:
2001年,McIntire等研究发现了一个新的基因家族,结构上含有免疫球蛋白V区和粘蛋白区,因此命名为T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子(Tcellimmunoglobulin-andmucin-domain-containingmolecules,Tim)家族。Tim蛋白特定地表达于Th1或Th2细胞上,是新的区分Th1和Th2的重要标志,在T细胞分化、T细胞效应功能以及自身免疫病、变态反应、哮喘等疾病中发挥重要作用。人的Tim基因家族定位在染色体5q33.2上,包括3个基因,Tim-1、Tim-3、Tim-4。Tim-3基因编码含有281个氨基酸的I型膜蛋白,Tim-3蛋白特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面,而不表达于Th2。细胞Tim-3蛋白通过与Tim-3配体相互作用调节Th1的免疫应答。Gal-9是Tim-3的天然配体,Gal-9/Tim-3信号通路通过诱导T细胞凋亡在免疫耐受的诱导及自身免疫病防治中发挥重要作用。Tim-3参与炎症发生发展过程,并通过调节巨噬细胞的活化及功能,抑制组织破坏性免疫应答,而在自身免疫性疾病中发挥重要的调节作用。研究发现,实验性自身免疫性脑脊髓炎是Th1细胞介导的一种自身免疫性中枢神经系统疾病,PCR检测发现脑组织和淋巴结中Tim-3表达上调,阻断Tim-3信号通路后,中枢神经系统中浸润的中性粒细胞和单核细胞明显增加。非肥胖症糖尿病是一种自身免疫性疾病,构建非肥胖症糖尿病小鼠模型,使用Tim-3单克隆处理加速了小鼠非肥胖症糖尿病发生,可能机制为:Tim-3与Tim-3L结合,对Th1细胞产生抑制性信号,发挥免疫调节功能,从而降低炎症,降低自身免疫应答;阻断了Tim-3信号通路后促进了自身免疫应答,加速了炎症。在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中,由于Tim-3表达的升高,导致Th1细胞的功能受到抑制,进而打破体内的免疫平衡,引起病理性的Th2细胞的活性增强,导致疾病的发病。在这种情况下,任何阻断Tim-3信号通路的方法均能有利于体内免疫平衡的恢复,缓解疾病的进程。例如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3与其配体的结合,增强Th1细胞活性,纠正由Th2细胞介导的哮喘症状,恢复体内Th1/Th2细胞平衡。上述研究资料表明,Tim-3通路具有重要的免疫调节功能,Tim-3表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。尽管研究表明Tim-3的中和抗体在某些疾病模型中发挥了很好的干预作用,但是,目前并没有上市的具有中和活性的Tim-3抗体。因此,提供一种特异性强的Tim-3抗体,对某些疾病的发病机理研究、疾病诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素:
为了弥补现有技术的缺陷,本发明的目的之一在于提供了一种抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分。所述单克隆抗体或其抗原结合部分能够特异性的结合Tim-3蛋白,抑制Tim-3蛋白的活性,即本发明的抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分既具有与Tim-3蛋白结合的结合活性又具有中和Tim-3蛋白活性的中和活性。本发明的目的之二在于提供上述抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分的用途。所述用途包括用于制备免疫检测工具,还包括制备治疗与Tim-3表达相关的疾病的药物制剂。本发明的目的之三在于提供一种检测人Tim-3的方法。所述方法利用了上述抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分与Tim-3的结合活性。为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:本发明提供了一种抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分,所述单克隆抗体或其抗原结合部分包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3;轻链CDR1具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列;轻链CDR2具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列;轻链CDR3具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列;重链CDR1具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列;重链CDR2具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列;重链CDR3具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。优选地,本发明提供的单克隆抗体,其轻链可变区具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。优选地,本发明提供的单克隆抗体,其重链可变区具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。进一步,本发明的单克隆抗体可以是全单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链抗体中的任意一种,只要其能与人Tim-3蛋白结合并能中和Tim-3的功能活性即可。Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。Fv指的是能结合完整的抗原结合位点的抗体的最小片段。一个Fv片段包括一条轻链的可变区结合到一条重链的可变区。单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Houston1988)。本发明提供的上述单克隆抗体可以由杂交瘤细胞产生。在本发明的具体实施方案中,由杂交瘤细胞产生单克隆抗体L3B的步骤如下:(1)BALB/c小鼠免疫;(2)细胞融合:取步骤(1)的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按照常规方法进行细胞融合;(3)筛选杂交瘤细胞;(4)进行抗体类型及亚型鉴定;(5)杂交瘤的培养;(6)单克隆抗体的纯化。步骤(1)的详细操作过程如下:将溶于PBS的重组人Tim-3抗原溶液与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化,经四肢肌肉多点注射,每只每次注射重组Tim-3抗原5μg(总体积50μL)。首次免疫后15d和29d,分别用同样剂量的重组抗原溶液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。融合前72h,尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原1次进行加强免疫。制备杂交瘤细胞使用的骨髓瘤细胞应该具有融合率高,抗体分泌能力稳定、对HAT(Sigma)-RPMI1640培养液敏感等能力。优选地,骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤,如MOP-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA),和SP2/0或X63-Ag8-653细胞株(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。在本发明的具体实施方案中,骨髓瘤细胞选用SP2/0。步骤(2)的详细操作过程如下:先把脾脏研磨得到脾细胞悬液,细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,混合后离心,经50%聚乙二醇(PEG2000)作用1min,使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。加入50mL含有20%FBS的RPMI1640培养基重悬融合细胞,将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后,分置于96孔细胞培养板中(200μL/孔)于5%CO2培养箱(ESPECBNA-311)37℃培养。3d后,用含有20%FBS的HT培养基(含有1.361mg黄嘌呤(hypoxanthn,H)、0.388mg胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)),加入RPMI1640(GIBCO公司)培养基至100mL,45-50℃条件下溶解后,过滤除菌。半保留换液。杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗结合特异性的方法有免疫沉淀或体外结合试验,如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA),流式细胞术(FACS)。在本发明的具体实施方案中,筛选表达Tim-3抗体的杂交瘤细胞使用的是间接ELISA方法,该方法的具体操作步骤如下:用10μg/mL重组人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板,于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃1h,PBST洗板4次),以及1:500稀释的50μLHRP-GAM(37℃45min,PBST洗板4次)。以TMB底物显色后,于450nm波长测定OD值。当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性确定之后,目的细胞株可以通过有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外,杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。通过有限稀释法进行杂交瘤细胞的亚克隆化的具体操作步骤如下:用间接ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆,直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法:①在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞:脱颈处死昆明小鼠,75%酒精浸泡消毒皮肤,无菌剥离腹部皮肤,注射器抽取5mL1640培养液注入小鼠腹腔,反复冲洗后吸出腹腔洗液,用加20%胎牛血清的1640培养液稀释后滴入96孔板,每孔约0.1mL。②取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中,并准确计数。③有限稀释法进行亚克隆。④将培养板置于37℃的5%CO2孵箱中培养,5天后在显微镜下观察细胞克隆。适时换液,检测,取阳性单克隆细胞株进行扩大培养,及时冻存细胞株。在本发明的具体实施方案中,将杂交瘤细胞移植到动物体内生长,具体操作步骤如下:稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在CO2培养箱中扩增培养,经96孔培养后转移至24孔,再转移至50mL细胞瓶中扩增培养。取10周龄的健康BALB/c小鼠,腹腔注射0.5mL/只液状石蜡,1-2周后,每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,7-10d后收集腹水。3000rpm离心15min,吸取中间澄清部分的液体,0.45μm的微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存。利用传统的免疫球蛋白纯化方法,如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等,可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。在本发明的具体实施方案中,分离纯化单克隆抗体采用的是透析的方法,具体操作过程如下:将腹水用0.02M、pH7.4的PBS(81mL0.2MNa2HPO4,19mL0.2MNaH2PO4,加生理盐水至1L)对倍稀释,搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度),4℃过夜。4℃,12000rpm离心15min,弃上清,将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵浓度达到33%饱和度,4℃静置过夜。4℃,12000rpm离心15min,弃上清,将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度),4℃过夜。4℃,12,000rpm离心15min,弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中,装入透析袋中,放入50-100倍含20mMNaCl,pH7.8的120mMTris-HCl缓冲液中4℃搅拌下脱盐12h左右,期间更换3次以上透析液。取出后分装-20℃保存。本发明的单抗还可以通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增,可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞,如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。本发明的单克隆抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Methods24:107-117(1992)andBrennan等人,Science229:81(1985))。另外,这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999);Little等人,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如,Fab’片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等人,Bio/Technology,10:163-167(1992))。再如,F(ab’)2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外,Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。本发明还提供了上述单克隆抗体L3B轻链可变区、重链可变区氨基酸序列的DNA编码序列:SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的DNA编码序列如SEQIDNO:9所示;SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的DNA编码序列如SEQIDNO:10所示。本发明还提供了获得单克隆抗体L3B轻链可变区、重链可变区核苷酸序列和氨基酸序列的方法。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增,可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内,然后转染宿主细胞,如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。在本发明的具体实施方案中,获得单克隆抗体L3B轻链可变区、重链可变区核苷酸序列和氨基酸序列的方法的具体操作步骤如下:1、抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建首先,获得人Tim-3蛋白,免疫BALB/c小鼠,用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆,直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。对所得杂交瘤细胞进行了染色体核型分析,杂交瘤细胞染色体平均数目为108条,用双相琼脂扩散实验证明所得杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。2、单克隆抗体L3B的轻链可变区、重链可变区基因的钓取和轻链可变区、重链可变区基因的确定提取所得杂交瘤细胞的RNA,经RT-PCR,用特异性引物分别钓取抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因。采用常规方法将所得轻链可变区基因转入载体、转化感受态细菌,培养后挑取单个菌落,提取质粒PCR鉴定正确后,进行DNA测序;将所得重链可变区基因转入载体、转化感受态细胞,培养后挑取单个菌落,提取质粒PCR鉴定正确后,进行DNA测序;经序列分析、比对,获得了单克隆抗体L3B的轻链可变区基因和重链可变区基因。所得单克隆抗体L3B的轻链可变区基因序列为SEQIDNO:9所示核苷酸序列,重链可变区基因序列为SEQIDNO:10所示核苷酸序列。3、单克隆抗体L3B轻链、重链可变区氨基酸序列的确定用www.expasy.org在线软件将编码人Tim-3单克隆抗体L3B的轻链、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列,单克隆抗体L3B的轻链、重链可变区氨基酸序列分别为SEQIDNO:7所示氨基酸序列、SEQIDNO:8所示氨基酸序列所示。根据Kabat数据库确定单克隆抗体L3B轻链可变区序列中的互补决定区轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。重链可变区序列中的互补决定区重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。本发明还提供了一种表达载体,所述表达载体包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示的核苷酸序列。本发明中“载体”一词指的是,可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说,载体包括:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分,如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳,但不仅仅只有这些物质。优选地,本发明中使用的载体质粒为pcDNA3.1质粒。本发明还提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包含上述表达载体。本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞,包括如下许多细胞类型,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞,或者如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞的动物细胞。进一步,优选所述宿主细胞为哺乳动物细胞。本发明还提供了一种利用基因重组技术制备前面所述的抗人Tim-3的单克隆抗体L3B的方法,所述方法的具体操作步骤如下:(1)获得编码轻链的DNA分子,该DNA分子包含具有SEQIDNO:9所示核苷酸序列;获得编码重链的DNA分子,该DNA分子包含具有SEQIDNO:10所示核苷酸序列;(2)取步骤1所得编码轻链的DNA分子,与第一表达载体融合,构建第一重组表达载体;取步骤1所得编码重链的DNA分子与第二表达载体融合,构建第二重组表达载体;(3)取所得步骤2所得第一重组表达载体、第二重组表达载体,引入哺乳动物细胞中,表达,纯化,即得。现有技术中存在多种将核酸引入宿主细胞的方法。对于真核细胞而言,适宜的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其他病毒的转导,例如牛痘,对于昆虫细胞,使用杆状病毒。对于细菌细胞而言,适宜的技术包括氯化钙转染、电穿孔和使用细菌噬菌体的转染。例如通过在使基因表达的条件下培养宿主细胞,在引入之后引起或允许核酸的表达。在本发明的具体实施方案中,将核酸引入宿主细胞使用是脂质体介导的转染的方法。本发明提供了一种免疫偶联物,其特征在于,该免疫偶联物含有:(a)本发明的单克隆抗体L3B或其抗原结合部分;和(b)选自下组的偶联部分:药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。本发明还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括前面所述的抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分和药剂学上可接受的载剂。本发明所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载剂”应当与本发明的活性物质相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。这些载剂是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPub.Co.,N.J.1991年)中可找到关于药学上可接受的载剂的充分讨论。药剂学上可接受的载剂包括,例如,一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物,以及上述物质的组合。药学可接受的载剂可进一步包括能提高抗体或其活性片段或其同源物的保存期限或效用的微量辅助物质,例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。前面所述的药物组合物可以制备成许多不同形式。这些包括,例如,固体、半固体和液体的剂型,例如片剂、丸剂、粉末、溶液、分散液、悬浮液、脂质体、栓剂、注射用及输液用溶液。本发明的药物组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药;优选的是口服或静脉内注射给药。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型,并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。使用药物组合物时,是将安全有效量的抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常约0.1μg-5mg/kg体重,而且在大多数情况下不超过约5mg/kg体重,较佳地该剂量是约1-10μg/kg体重-约1mg/kg体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围内的。本发明的药物组合物还可包含对自身免疫性疾病有治疗或改善活性的物质,或可与其它活性物质联合使用,以获得更佳的治疗效果。当两种或两种以上的药物联合给药时,一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。优选地,联合施用的药物或其它制剂不干扰本发明单克隆抗体或其抗原结合部分的治疗活性。本发明还提供了一种人Tim-3的免疫检测工具,所述免疫检测工具包括抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地,本发明提供的应用中的免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本发明还提供了一种检测人Tim-3表达水平的方法,所述方法包括以下步骤:(1)提取含有人Tim-3蛋白的样品;(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分接触;(3)检测步骤(1)获取的样品中Tim-3蛋白与前面所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的反应。检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。在本发明的具体实施方案中,检测人Tim-3表达水平的方法的具体操作步骤如下:(1)4℃条件下,包被本发明的抗人Tim-3的单克隆抗体16h~18h;(2)加入生物样品,37℃孵育1h;(3)加入兔抗人Tim-3多克隆抗体(购自Abcam公司),37℃孵育1h;(4)加入HRP标记羊抗兔抗体,经37℃孵育0.5h之后,显色,终止,检测;(5)根据检测结果判断生物样品中所含的人Tim-3的浓度。本发明还提供了前面所述的抗人Tim-3单克隆抗体或其抗原结合部分在免疫检测工具中的应用。所述免疫检测工具用来检测样品中人Tim-3的表达水平。所述免疫检测工具可以是芯片、试剂盒或试纸。本发明还提供了前面所述的抗人Tim-3单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测人Tim-3表达水平的免疫偶联物中的应用。所述免疫偶联物包括:(a)本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分;和(b)选自下组的偶联部分:药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。本发明还提供了前面所述的抗人Tim-3单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗与Tim-3异常表达相关的疾病的药物制剂中的应用。进一步,所述疾病包括HIV感染导致的疾病、HCV感染导致的疾病、HBV感染导致的疾病、自身免疫性疾病、脓毒症。所述药物制剂包括本发明的抗人Tim-3单克隆抗体或其抗原结合部分和/或药物学上可接受的载剂。进一步,上述药物制剂包括前面所述的抗人Tim-3的单克隆抗体或其抗原结合部分和药剂学上可接受的载剂。附图说明图1显示本发明的单克隆抗体L3B检测Tim-3蛋白的灵敏度;图2显示本发明的单克隆抗体L3B对Tim-3蛋白功能的影响。具体的实施方式下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中未注明来源的实验试剂,均可从商业途径获得。实施例1抗人Tim-3单克隆抗体L3B的制备1、材料福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂,显色试剂TMB:Sigma公司产品;20%胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所产品;无血清RPMI1640:Gibco公司产品;SP2/0细胞:ATCC引进,军事医学科学院基础医学研究所保存;BALB/c小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供;重组人Tim-3(rhTim-3)由军事医学科学院基础医学研究所制备。其余试剂均为市购。2、方法使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体,详细方法参见:EdHarlow等人,AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988。简要过程如下:(1)小鼠免疫:选用4-6周龄的雌性BALB/c小鼠作为实验对象,将溶于PBS的重组人Tim-3抗原溶液与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化,经四肢肌肉多点注射,每只每次注射重组Tim-3抗原5μg(总体积50μL)。首次免疫后15d和29d,分别用同样剂量的重组抗原溶液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。融合前72h,尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原1次进行加强免疫。(2)细胞融合:将经过免疫的小鼠脾脏研磨得到脾细胞悬液,细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,混合后离心,经50%聚乙二醇(PEG2000)作用1min,使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。加入50mL含有20%FBS的RPMI1640培养基重悬融合细胞,将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后,分置于96孔细胞培养板中(200μL/孔)于5%CO2培养箱(ESPECBNA-311)37℃培养。3d后,用含有20%FBS的HT培养基(含有1.361mg黄嘌呤(hypoxanthn,H)、0.388mg胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)),加入RPMI1640(GIBCO公司)培养基至100mL,45~50℃条件下溶解后,过滤除菌。半保留换液。(3)用间接ELISA筛选抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞:用10μg/mL重组人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板,于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃1h,PBST洗板4次),以及1:500稀释的50μLHRP-GAM(37℃45min,PBST洗板4次)。以TMB底物显色后,于450nm波长测定OD值。(4)杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定:用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,对所得杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验,结果表明上述杂交瘤细胞培养上清只能与羊抗鼠IgG2a抗体形成结合条带,证明本实施例所得杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。通过上述步骤,筛选到人Tim-3单克隆抗体,命名为L3B。(5)杂交瘤细胞克隆化:用间接ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆,直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法:①在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞:脱颈处死昆明小鼠,75%酒精浸泡消毒皮肤,无菌剥离腹部皮肤,注射器抽取5mL1640培养液注入小鼠腹腔,反复冲洗后吸出腹腔洗液,用加20%胎牛血清的1640培养液稀释后滴入96孔板,每孔约0.1mL。②取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中,并准确计数。③有限稀释法进行亚克隆。④将培养板置于37℃的5%CO2孵箱中培养,5d后在显微镜下观察细胞克隆。适时换液,检测,取阳性单克隆细胞株进行扩大培养,及时冻存细胞株。(6)杂交瘤的培养:稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在CO2培养箱中扩增培养,经96孔培养后转移至24孔,再转移至50mL细胞瓶中扩增培养。取10周龄的健康BALB/c小鼠,腹腔注射0.5mL/只液状石蜡,1-2周后,每只小鼠腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,7-10d后收集腹水。3000rpm离心15min,吸取中间澄清部分的液体,0.45μm的微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存。(7)单克隆抗体的纯化:将腹水用0.02M、pH7.4的PBS(81mL0.2MNa2HPO4,19mL0.2MNaH2PO4,加生理盐水至1L)对倍稀释,搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度),4℃过夜。4℃,12000rpm离心15min,弃上清,将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵,使硫酸铵浓度达到33%饱和度,4℃静置过夜。4℃,12000rpm离心15min,弃上清,将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50%饱和度),4℃过夜。4℃,12,000rpm离心15min,弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中,装入透析袋中,放入50-100倍含20mMNaCl,pH7.8的120mMTris-HCl缓冲液中4℃搅拌下脱盐12h左右,期间更换3次以上透析液。取出后分装-20℃保存。实施例2人Tim-3单克隆抗体L3B轻链可变区、重链可变区基因的钓取1.材料(1)轻链可变区上下游引物轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7,其序列分别见序列表SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13;轻链下游引物MuCK,其序列见序列表SEQIDNO:14,引物在PCR扩增时的使用浓度均为10pmol/μL。(2)重链可变区上下游引物重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8,其序列见序列表SEQIDNO:15、SEQIDNO16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18;重链下游引物MuIgG2a见序列表中SEQIDNO:19,引物在PCR扩增时的使用浓度为10pmol/μL。(3)DNA片段纯化试剂盒:OMEGA生物科技公司产品;T4DNA连接酶:NewEnglandBiolabs产品;载体PGEMTeasy:Promega公司产品;感受态细菌JM109:购自Promega公司。其余试剂来源同实施例1。2.方法(1)取对数生长期的实施例1制备的单克隆抗体L3B的细胞株5×(106~107)个,离心去除上清,将细胞均匀弹起。加1mLTRIzol(Invitrogen)反复吹打使细胞充分裂解,振荡5min后,加入0.2mL氯仿,振荡15秒,室温放置2~3min,2℃-8℃12000r/min,离心15min,取上清于另一新管中,加500μL异丙醇混匀后室温放置10min,2℃~8℃12000r/min离心10min。75%乙醇洗涤沉淀,干燥后,用20μL无RNA酶的去离子水溶解沉淀。(2)取含1μg总RNA的溶液,依次加入AMV5×缓冲液4μL,Oligo(dT)(500ng/μL)0.5μL,2.5mmol/LdNTP2μL,RNasin(50U/μL)0.5μL,补去离子水至20μL、反转录酶2-5U,42℃延伸1h。95℃变性5min,置冰浴中,所得产物为cDNA第一链。分别用特异性引物扩增轻链可变区基因和重链可变区基因。轻链可变区基因扩增体系:取上述所得产物,即反转录产物2μL,Taq酶10×buffer2μL,轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7各1μL,下游引物MuCK3μL,2.5mmol/LdNTP4μL,加Taq酶1~2U,补去离子水至50μL。PCR扩增条件为:95℃变性2min,循环参数为:94℃1min,55℃1min,72℃1min,共30个循环,72℃后延伸10min,将所得扩增产物标记为扩增产物1。重链可变区基因扩增体系:取上述所得产物,即反转录产物2μL,Taq酶10×buffer2μL,重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8各1μL,下游引物MuIgG2a3μL,2.5mmol/LdNTP4μL,加Taq酶1~2U,补去离子水至50μL。PCR扩增条件为:95℃变性2分钟,循环参数为:94℃1min,55℃1min,72℃1min,共30个循环,72℃后延伸10min,将所得扩增产物标记为扩增产物2。(3)用琼脂糖凝胶电泳分别分离出扩增产物1和扩增产物2中欲回收的DNA片段,即目的DNA片段,在长波紫外光下分别切下含目的DNA片段的胶块,放入离心管中,一一标记,加入三倍胶体积的化胶液,55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒分别回收扩增产物1中目的DNA片段和扩增产物2中的目的片段中并将纯化的DNA片段溶解在水溶液里,分别标记,将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2:1的比例(摩尔比)和载体PGEMTeasy混合后,加入0.5U的T4DNA连接酶于16℃连接过夜,连接反应的总体积为10μL,并一一对应标记。(4)取上述所得连接液10μL,加于200μL感受态细菌JM109中并轻柔混匀,冰浴30min,42℃水浴热休克90s,迅速转入冰浴2min,加800μLLB培养基,转入37℃恒温摇床,以150r/min的速度摇动45min,4000r/min离心1min,弃去800μL上清,取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/mL)的固体LB平板,将平板倒置于37℃孵箱12-18h,并一一对应标记。(5)在所得上述平板中挑取单个克隆,接种于含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB培养基中,并一一对应标记。37℃恒温摇床170r/min,震荡培养过夜。分别取3mL菌液加入1.5mLEppendorf管中,10000r/min离心1min,弃上清。采用质粒提取试剂盒,将沉淀菌体重悬于100μL溶液Ⅰ中,加新鲜配制的溶液Ⅱ200μL,轻缓地上下颠倒数次,至液体变清澈为止。随后,再加入150μL溶液Ⅲ,轻柔地上下颠倒数次使液体混匀,此时出现大量白色絮状沉淀。4℃,12000r/min离心5min,取上清加至另一Eppendorf管中,加入等体积的Tris-HCl饱和酚,剧烈震荡后,12000r/min离心5min,将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿,重新抽提一次。其后,小心吸取上层水相,移至一新管中,加2倍体积的无水乙醇混匀,于-20℃放置3h。4℃,12000r/min离心10min,弃上清,用70%乙醇洗沉淀2次,室温干燥20min,以40μL无菌双蒸水溶解,进行PCR鉴定及DNA测序分析。通过上述步骤构建了含有人Tim-3的单克隆抗体L3B轻链可变区基因的载体、重链可变区基因的载体。经序列比对,获得了编码单克隆抗体L3B的轻链可变区的核苷酸序列和编码单克隆抗体L3B的重链可变区的核苷酸序列。所得编码单克隆抗体L3B的轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:9所示核苷酸序列;所得编码单克隆抗体L3B的重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:10所示核苷酸序列,其对应的氨基酸序列分别为SEQIDNO:7所示氨基酸序列、SEQIDNO:8所示氨基酸序列。实施例3单克隆抗体L3B的表达和纯化1.材料ProteinASepharoseCL4B柱蛋白柱:北京本元正阳生物技术有限公司产品;pcDNA3.1质粒:Invitrogen;其余试剂和材料的来源同实施例1。2.方法将实施例2获得的单克隆抗体L3B轻链可变区基因,轻链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒,得含单克隆抗体L3B轻链基因的载体;将实施例2获得的单克隆抗体L3B重链可变区基因,重链恒定区基因装入pcDNA3.1质粒,获得含单克隆抗体L3B重链基因的载体。含有单克隆抗体L3B轻链基因的载体、重链基因的载体共转染转入哺乳动物细胞中,进行表达。收集表达上清,加入1mLpH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液并用1mol/LTRIS-HCL调整pH至9.0。把小鼠腹水加入已经用pH8.0、0.1mol/L磷酸缓冲液平衡好的ProteinASepharoseCL4B蛋白柱中,用上述缓冲液洗柱子,直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱,收集流出液,并立即用1mol/LpH8.5TRIS-HCL缓冲液中和,用pH7.2,0.01mol/L的PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280,计算蛋白质含量,冻干后于-20℃保存。实施例4单克隆抗体L3B与人Tim-3结合特异性的检测1.材料脓毒症患者血清为收集于解放军总医院脓毒症病人的血液经处理获得;正常人血清为收集于正常人的血液经处理获得;ELISA包被液、PBST、TMB、H2SO4、TNF-α、硫氧环蛋白均为市售,其余试剂和材料的来源同实施例1。2.方法和结果采用间接ELISA方法考察实施例3制得的单克隆抗体L3B的特异性。实验设对照组1、对照组2、对照组3、实验组、阳性对照组、阴性对照组。其中对照组1包被无关抗原TNF-α1μg/mL,对照组2包被无关抗原硫氧环蛋白(TRX)1μg/mL;对照组3包被BSA1μg/mL;实验组包被脓毒症病人血清;阳性对照组包被人Tim-3抗原(即重组人Tim-3)1μg/mL;阴性对照组包被正常人血清。每组样品用包被液稀释,每个样品包被2孔于ELISA板中,每孔100μL,4℃过夜。PBST洗5遍,封闭,200μL封闭液,37℃,封闭2h,PBST洗5遍。按10μg/mL的终浓度加入单克隆抗体L3B50μL,37℃反应1h,PBST洗5遍。加入300×稀释anti-mouse抗体(KPL公司),37℃反应45min。PBST洗7遍,加入50μL/孔的TMB,室温避光孵育10min后,加入50μL/孔的1mol/L的硫酸终止反应,酶标仪检测450nm处OD值,计算每组两孔数值的平均值。单克隆抗体L3B特异性检测结果见表1。表1单克隆抗体L3B特异性检测结果根据表1中数据可知,阴性对照组、对照组1、对照组2和对照组3(三个无关蛋白对照)的四个组别的OD450值差异不显著,说明实施例3制得的单克隆抗体L3B不与无关蛋白相结合;与阴性对照组相比较,阳性对照组和实验组OD450值差异及其显著,呈现明显的阳性结果。实验组与阳性对照组的OD450值相当,实验组中含有人Tim-3抗原,说明实施例3制得的单克隆抗体L3B能够特异性与人Tim-3相结合,而不与其他蛋白结合,可以用于制备检测人Tim-3的免疫检测工具。实施例5抗人Tim-3的单克隆抗体L3B的灵敏度检测1、操作步骤:步骤1:包被单克隆抗体L3B到高亲和力ELISA板中,4℃过夜后用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次;步骤2:取蛋白标准品重组人Tim-3蛋白,配置成不同的浓度(浓度分别为0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL和10000ng/mL),加入到步骤1所得的包被有L3B的ELISA板条中,37℃孵育1h,用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次;步骤3:加入兔抗人Tim-3的多克隆抗体,37℃孵育1h,用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次;步骤4:加入HRP标记羊抗兔抗体,37℃孵育0.5h之后,用含0.2%吐温的PBS缓冲液洗涤5次;加入TMB显色,1mol/L的硫酸终止后检测OD450的值。步骤5:以OD450值和蛋白浓度做图,判断生物样品中所含的人Tim-3的水平。2、结果检测结果见图1,对其进行分析可知,实验组中随着蛋白浓度的增加,OD450值逐渐增大,其检出限为0.1ng/mL到1000ng/mL,与已报道的人Tim-3的最低检出限1ng/mL相比,显著提高了人Tim-3检测试剂盒的检出限和灵敏度。实施例6单克隆抗体L3B中和活性的检测1、应用免疫磁珠法建立人外周血CD4+T细胞增殖模型1.1获得血液标本采集健康人肘静脉血50mL,加入肝素(10U/mL)抗凝。1.2用淋巴细胞分离液从血标本中分离单个核细胞(MNC)(1)用肝素抗凝的50mL静脉血与50mLRPMI-1640溶液充分混匀稀释;(2)取8个50mL规格的塑料离心管,在各管中加入25mL淋巴细胞分离液(购自鼎国生物科技有限公司);(3)将上述稀释的血液用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面;水平离心(2000r/m×20min);(4)离心后管内分为三层,上层为血浆和RPMI-1640溶液,下层主要为红细胞和粒细胞;中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有少量血小板;(5)毛细滴管插到云雾层,吸取单个核细胞,并集中移至1支离心管中;加入10mlRPMI-1640溶液,水平离心(1500r/m×10min)后去上清液,再加入10mlRPMI-1640溶液,水平离心(1500r/m×10min);(6)末次离心后弃上清液,加入5mL10%FCSRPMI-1640重悬细胞,镜下细胞计数为2.5×107个,调整浓度为0.5×107个/mL,平均分装于5支小试管,在4℃保存待下步使用。1.3用Dynal人CD4+T细胞阳性分选试剂盒(挪威dynal公司)分选CD4+T细胞按照试剂盒操作说明书进行CD4+T细胞分选。1.4显微镜下观察细胞(1)形态:细胞形态均一,边缘清晰,细胞体明亮无异常,无细菌等生物生长;(2)活度,0.4%台盼蓝溶液染色,3min内用血球记数板分别计数活细胞和死细胞,依据公式:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%,得出分选的CD4+细胞活度为97%。2、CD4+T细胞培养及定向分化将上述分离的CD4+T淋巴细胞以5×105的密度置于96孔板中,充分混匀,同时加入anti-CD3(终浓度为2.5μg/mL)、anti-CD28(终浓度为5μg/mL)、IL-2(终浓度为100ng/mL)(三种试剂购自美国eBio-science)刺激细胞增殖,另外加入终浓度为10ng/mL的白细胞介素-12(IL-12)和终浓度为10μg/mL的anti-IL-4(两种试剂购自美国eBio-science)诱导细胞定向分化成Th1细胞。继续培养5d。3、CD4+T定向分化细胞的干预实验分别将培养5d后的所有定向分化细胞分为三组,进行下列干预实验:(1)空白对照组:细胞培养液总不加入任何药物;(2)人重组半乳素凝集素-9(rGal-9)(购自艾美捷科技有限公司):细胞培养液中加入终浓度为7.5μg/mL的rGal-9;(3)rGal-9+Tim-3单克隆抗体组:细胞培养液中加入终浓度为7.5μg/mL的rGal-9和终浓度为2μg/mL的Tim-3的单克隆抗体;继续培养6h后,收集细胞进行流式检测。4、流式细胞仪检测细胞凋亡按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(LifeTechnologies)中说明书记载的操作步骤进行细胞凋亡的检测,每组细胞三个平行样。细胞凋亡实验进行三批,计算平均值。5、数据统计以空白对照组的细胞存活率为基准(即对照组的细胞存活率为100%),计算其余各组的相对存活率。所有数据均用统计软件SPSS18.0进行分析,实验数据均以平均值±标准差表示,并进行单因素方差分析和独立样本t检验,*代表P<0.05,为差异有统计学意义。所有实验至少重复3次。6、结果结果如图2所示,与空白对照组相比,加入rGal-9的实验组细胞存活率降低,在此基础上加入Tim-3的单克隆抗体L3B细胞存活率回升。上述结果表明,rGal-9与CD4+T分化细胞表面表达的Tim-3蛋白相互作用,促进细胞凋亡,而Tim-3的单克隆抗体通过干扰rGal-9与Tim-3蛋白的相互作用,抑制了细胞凋亡的进程,由此证明本发明制备的Tim-3的单克隆抗体L3B不仅具有与Tim-3蛋白结合的结合活性,而且具有中和Tim-3蛋白活性的中和活性。以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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