本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗人pd-1的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
：人程序性细胞死亡受体-1(pd-1)是一种有288个氨基酸的i型膜蛋白，是已知的主要免疫检查点(immunecheckpoint)之一(blanketal,2005,cancerimmunotherapy,54:307-314)。pd-1表达在已经激活的t淋巴细胞，它与配体pd-l1(程序性死亡受体-配体1，programmedcelldeath-ligand1)和pd-l2(程序性死亡受体-配体2，programmedcelldeath-ligand2)结合可以抑制t淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。pd-l2主要表达在巨噬细胞和树突状细胞，而pd-l1则广泛表达于b、t淋巴细胞及外周细胞如微血管上皮细胞，肺、肝、心等组织细胞中。大量研究表明，pd-1和pd-l1的相互作用不但是维持体内免疫系统平衡所必须，也是导致pd-l1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制和原因。通过阻断癌细胞对pd-1/pd-l1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进t细胞相关的肿瘤特异性细胞免疫反应，从而打开了一扇新的肿瘤治疗方法的大门——肿瘤免疫疗法。pd-1(由基因pdcd1编码)为与cd28和ctla-4有关的免疫球蛋白超家族成员。研究成果显示，当pd-1与其配体(pd-l1和/或pd-l2)结合时会负调节抗原受体信号转导。目前已弄清鼠pd-1结构以及小鼠pd-1与人pd-l1的共结晶结构(zhang，x.等，immunity20：337-347(2004)；lin等，proc.natl.acad.sci.usa105：3011-6(2008))。pd-1及类似的家族成员为i型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的ig可变型(v-型)结构域和负责结合信号转导分子的胞质尾区。pd-1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体itim(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和itsm(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。pd-1在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。肿瘤免疫疗法，即利用人体自身的免疫系统抵御癌症，是一种突破性的肿瘤治疗方法，但是肿瘤微环境可保护肿瘤细胞免受有效的免疫破坏，因此如何打破肿瘤微环境成为抗肿瘤研究 的重点。现有研究成果已确定了pd-1在肿瘤微环境中的作用：pd-l1在许多小鼠和人肿瘤中表达(并在大多数pd-l1阴性肿瘤细胞系中可由ifnγ诱导)，并被推定为介导肿瘤免疫逃避的重要靶点(iwaiy.等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.99：12293-12297(2002)；stromes.e.等，cancerres.，63：6501-6505(2003)。通过免疫组织化学评估活组织检查，已经在人的很多原发性肿瘤中发现pd-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或pd-l1在肿瘤细胞上的表达。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤等。由此可见，阻断pd-1/pd-l1的相互作用可以提高肿瘤特异性t细胞的免疫活性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞，因此pd-1成为开发肿瘤免疫治疗药物的热门靶点。然而，现有的抗pd-1单克隆抗体还存在选择性不强、亲和力较低的缺陷。因此，研发新型抗pd-1的单克隆抗体，并将其应用到治疗肿瘤、抗自身免疫性疾病等相关药物的制备，成为亟待解决的技术问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服目前抗人pd-1单克隆抗体存在选择性较弱，亲和力较低的缺陷，提供了一种新的抗人pd-1的单克隆抗体，同时还提供了该单克隆抗体的制备方法和应用，从而完成了本发明。因此，本发明的第一个目的在于提供一种抗人pd-1的单克隆抗体。本发明的第二个目的在于提供编码所述抗人pd-1单克隆抗体的核苷酸分子。本发明的第三个目的在于提供包含所述核苷酸分子的表达载体。本发明的第四个目的在于提供包含所述表达载体的宿主细胞。本发明的第五个目的在于提供一种所述抗人pd-1单克隆抗体的制备方法。本发明的第六个目的在于提供包含所述抗人pd-1单克隆抗体的组合物。本发明的第七个目的在于提供所述抗人pd-1单克隆抗体在制备药物中的应用。为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：本发明采取的技术方案之一为：提供一种抗人pd-1的单克隆抗体，所述的单克隆抗体包含：(1)重链互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，所述cdr1的氨基酸序列如 seqidno：1所示，所述cdr2的氨基酸序列如seqidno：2所示，所述cdr3的氨基酸序列如seqidno：3所示，和(2)轻链互补决定区cdr1’、cdr2’、cdr3’，所述cdr1’的氨基酸序列如seqidno：4所示，所述cdr2’的氨基酸序列如seqidno：5所示，所述cdr3’的氨基酸序列如seqidno：6所示。本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有cdr1、cdr2和cdr3三个结构域。本发明所述的单链抗体为常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。较佳的，本发明所述抗人pd-1的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno：8所示，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno：10所示。本发明所述单克隆抗体可以由本领域常规技术制备，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，较佳地是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。本发明采取的技术方案之二为：一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如上所述的抗人pd-1单克隆抗体。其中所述核苷酸分子编码重链可变区的核苷酸序列较佳地如seqidno：7所示，编码轻链可变区的核苷酸序列较佳地如seqidno：9所示。本发明所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如pcr方法等，获得编码上述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。本领域技术人员知晓，编码上述单克隆抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该单克隆抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。本发明采取的技术方案之三为：一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核苷酸分子。其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的 噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见currentprotocolsinmolecularbiology，第二版，ausubel等编著。本发明所述表达载体较佳地为pdr1，pcdna3.1，pdhff，gm-csf或pcho1.0，更佳地为pcdna3.1。本发明采取的技术方案之四为：一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞核真核表达细胞，所述表达载体较佳地包括：cos、cho(中国仓鼠卵巢，chinesehamsterovary)、ns0、sf9、sf21、dh5α、bl21(de3)或e.colitg1，更佳地为e.colitg1、bl21细胞(表达单链抗体或fab抗体)或者cho-k1细胞(表达全长igg抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。本发明采取的技术方案之五为：一种如上所述的抗人pd-1的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：a)在表达条件下，培养本发明所述的宿主细胞，从而表达抗人pd-1的单克隆抗体；b)分离并纯化步骤a)所述的抗人pd-1的单克隆抗体。本发明所述的宿主细胞的培养方法，所述抗人pd-1单克隆抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及单克隆抗体分离纯化技术手册。本发明采取的技术方案之六为：一种组合物，所述组合物含有如上所述的抗人pd-1的单克隆抗体和药学上可接受的载体。本发明提供的抗人pd-1单克隆抗体，可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗人pd-1单克隆抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂， 通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述抗人pd-1单克隆抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的抗人pd-1单克隆抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的载体较佳地包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂较佳地包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；pluronics；monaquattm等，其加入量应使抗人pd-1单克隆抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂较佳地包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂较佳地包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液较佳地包括但不限于：tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。本发明采取的技术方案之七为：本发明所述的抗人pd-1的单克隆抗体在制备药物中的应用。本发明所述的药物较佳地为抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染性疾病和/或抗移植排斥反应的药物，更佳地为抗肿瘤药物、治疗自身免疫性疾病药物，优选地为抗肿瘤药物。本发明所述抗人pd-1的单克隆抗体可以单独使用或与抗pd-l1单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合使用。其中所述抗肿瘤药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌、胰腺癌和/或头颈肿瘤中的一种或多种。本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。本发明中抗pd-l1单克隆抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时， 给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明提供的抗人pd-1单克隆抗体具有良好的生物活性，能够有效结合人pd-1蛋白受体的胞外区，并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭pd-1蛋白，阻止pd-1蛋白与配体pd-l1和pd-l2的结合。该单克隆抗体能够单独或与其它抗肿瘤药物联合应用在肿瘤免疫治疗和pd-l1阳性肿瘤病人的诊断和筛查中，即能够有效运用于治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等药物的制备中。附图说明图1为pcdna3.1质粒结构示意图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。本发明中公开的抗人pd-1单克隆抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达抗人pd-1单克隆抗体；分离和纯化所述的抗人pd-1单克隆抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在sds-page电泳上为单一条带。可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗人pd-1单克隆抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变ph等方法洗脱结合在亲和柱上的单克隆抗体。本发明的发明人对所得抗人pd-1的单克隆抗体进行了检测实验，实验结果表明该单克隆抗体能很好地与人pd-1结合，具有较高的亲和力。实施例1pd-1抗原的制备为了产生抗人pd-1(hpd-1)的抗体，通过pcr方法获得编码人源pd-1全长氨基酸序列的可读框的cdna，并将所得cdna亚克隆到载体pcdna3.1(invitrogen，carlsbad，ca)得到hpd-1载体。其中所述载体pcdna3.1的结构如图1所示，所述cdna序列如seqidno:11所示，该序列的genbank编号为：bc074740.2。用所得hpd-1载体稳定转染cho-k1细胞(购自lifetechnologies公司)，用流式细胞术(facs)监测pd-1的表达，分离在其膜上表达人pd-1的cho-k1克隆，并将其命名为cho-hpd1，具体操作方法请参见相关的细胞技术手册。通过用helios基因枪(biorad)和涂覆dna的金弹(biorad)，根据制造商用法说明进行基因枪免疫接种小鼠。简言之，用2∶1∶1比例的所得hpd-1载体和市售小鼠flt3l表达载体及小鼠gm-csf载体(二者都购买自aldevron，fargond)涂覆1μm金微粒，用总质量为1μg的质粒dna来涂覆500μg的金弹。具体而言，对6～8周龄harbour人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司)进行免疫接种，小鼠在spf条件下饲养。用基因枪在harbour人源抗体转基因小鼠耳上进行冲击免疫接种，在双耳上接受2、3或4个周期的轰击，其中一只小鼠在腹腔接受5×106个cho-hpd1细胞的最后加强免疫接种。通过用细胞elisa方法检测cho-hpd-1克隆和cho-k1母体细胞，将结果进行对比后发现：dna免疫接种后的小鼠血清中抗体的滴度为1∶1000以上。所述细胞elisa的方法包括以下步骤：在50μl培养基(dmem/ham氏f12/10％fbs)中将cho-hpd-1细胞培养到80-100％汇合。接着加入50μl含有各种浓度的纯化mab的培养基，在37℃孵育1小时。在用pbs-tween洗涤3次后，加入100μl山羊-抗小鼠-hrp(southernbiotech，目录编号1030-05)(在培养基中以1∶1000稀释)，在37℃孵育1小时。在用pbs-tween再洗涤3次后，用显色过氧化物酶底物tmb(bdbiosciences)来显现固定化的免疫球蛋白。在微量滴定板读数器中读取吸光度的增加值(450nm)。实施例2杂交瘤的制备、筛选和建库在最后免疫接种后四天，处死小鼠，根据已有文献(steenbakkers等，1992，j.immunol.meth.152：69-77；steenbakkers等，1994，mol.biol.rep.19：125-134)，制备去除红细胞的脾细胞群，将所得脾细胞进行融合。取生长状态良好的杂交瘤sp2/0细胞(来源自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃、5％co2 孵箱中培养，融合前一天换液。融合与筛选过程如下：取小鼠脾脏，研磨洗涤后计数。按照脾细胞:sp2/0细胞＝10:1混合两种细胞，1500rpm离心7分钟。洗去上清液。1分钟内加入1mlpeg(1450)，轻摇90秒，在2.5分钟内加入无血清dmem培养液(购自gibco公司)5ml，再一次性加5ml无血清培养液终止反应，静置5分钟，1280rpm离心8分钟。按照一块96孔板两百万个sp2/0细胞的数量均匀接种入96孔板每孔200μl，先用含次黄嘌呤(hypoxanthine，h)、甲胺蝶呤(aminopterin，a)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，t)的hat培养基筛选，每3～4天半量换液，第10天改用ht培养基。14天后用elisa和acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将elisa中od450nm>1.0和acumen中mfi值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)ht胎牛血清，dmem(invitrogen)在37℃，5％(v/v)co2条件下扩大培养。其中所述的elisa方法步骤为：将纯化的免疫原pd-1或其他免疫检测点蛋白(购买自southernbiotech)分别用pbs稀释到终浓度1.0μg/ml，然后以100μl每孔加到96孔elisa板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板2次，加入封闭液[pbs+0.01％(v/v)tween20+1％(w/w)bsa]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加pd-1抗体(购买自southernbiotech)100μl每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板3次。加入hrp(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自sigma)，37℃孵育2小时后，用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板3次。加入tmb底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0nhcl)100μl每孔。用elisa读板机(购自moleculardevice)读取a450nm数值。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，采用上述elisa方法确定对pd-1蛋白和pd-1阳性细胞的结合活性。根据24孔板筛选结果，挑选elisa实验中od450nm>1.0、facs实验中mfi值>50和为符合条件的阳性克隆，并通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定表达所述pd-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将所得杂交瘤细胞株进行保种建库，并可用于后续的抗体生产和纯化。实施例3抗人pd-1单克隆抗体的生产和纯化杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1-15μg/毫升，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活 性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1-5毫克)抗体生产纯化。将实施例2所得的杂交瘤细胞接种到t-75细胞培养瓶并用生产培养基(hybridomaserumfreemedium，购自invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入500毫升生产培养基，接种细胞密度为1.0×105/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速5rpm。连续旋转培养16天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(500ml)中的单克隆抗体用3ml蛋白g柱(购自gehealthcare)纯化。蛋白g柱先用平衡缓冲液(pbs磷酸缓冲液，ph7.5)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白g柱，控制流速在5ml/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白g柱，平衡缓冲液的体积为5倍蛋白g柱柱床体积。用洗脱液(0.1m甘氨盐酸缓冲液，ph3.0)洗脱结合在蛋白g柱上的pd-1抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(a280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0mtris-hcl缓冲液中和ph值，所述百分比为体积百分比，然后立即用pbs磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析6小时。收集透析后的pd-1抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的pd-1单克隆抗体。将纯化的pd-1抗体进行蛋白浓度(a280/1.4)、纯度、内毒素(lonza试剂盒)等检测分析，检测结果显示：所得单克隆抗体终产品的内毒素浓度在1.0eu/毫克以内。实施例4抗人pd-1单克隆抗体的亲和力分析利用elisa方法测定抗人pd-1的单克隆抗体与人pd-1/fc的结合亲和力。通过室温孵育4小时(或在4℃过夜)将人hpd-1/fc(r&dsystems)固定化在maxisorp96-孔板(nunc)上。通过与含3％bsa的pbst室温孵育1小时来阻断非特异性结合位点。包被后，用pbst洗涤所述板3次。用结合缓冲液(含有0.1％tween20和0.3％bsa的pbs)制备本发明所述抗pd-1单克隆抗体以及市售可得阳性对照pd-1抗体的稀释液，将所得稀释液与固定化的融合蛋白在25℃下孵育1小时。结合后，用pbst洗涤所述板3次，在25℃下用含稀释至1/4,000的过氧化物酶标记的二抗(southernbiotech)的结合缓冲液孵育1小时，再次洗涤，用 tmb显色。用半最大结合浓度(ec50)表示相对结合亲和力的量值，检测结果如表1所示。表1、抗人pd-1的单克隆抗体对人pd-1的亲和力抗体ec50(pm)kd(1/s)kd(pm)本发明抗人pd-1的单克隆抗体761.35e+062.34e-11阳性对照pd-1抗体4208.42e+041.78e-09表1的结果可以说明，本发明所得抗人pd-1单克隆抗体的亲和力高于阳性对照pd-1抗体，能够有效与pd-1结合，具有较高的亲和力。实施例5抗人pd-1单克隆抗体基因序列的测定使用trizol(购自上海生工生物)提取实施例2所得杂交瘤细胞株的总rna，用逆转录试剂盒(购自takara公司)将mrna逆转录成cdna，通过pcr方法扩增抗人pd-1单克隆抗体的轻链和重链可变区基因，然后将pcr产物克隆入pmd18-t载体，交由生工公司测序并分析可变区基因序列。结果：所得pd-1单克隆抗体的重链可变区基因序列全长369bp，编码123个氨基酸残基，其核苷酸序列如seqidno：7所示，编码所得氨基酸序列如seqidno：8所示；轻链可变区基因序列全长336bp，编码112个氨基酸残基，核苷酸序列如seqidno：9所示，氨基酸序列如seqidno：10所示。在genebank中对氨基酸序列进行比对分析，二者均符合人pd-1可变区基因的特征。实施例6检测抗人pd-1单克隆抗体阻断pd-1蛋白与其配体pd-l1和pd-l2的结合通过pd-1蛋白的受体配体结合试验检测pd-1抗体阻断pd-1蛋白与其配体pd-l1和pd-l2的结合。制备pd-1胞外区蛋白(pd1-hfc)将含有编码人源pd-1蛋白胞外区氨基酸序列的核苷酸序列克隆到带有人iggfc片段(hfc)的pcpc载体(购自invitrogen)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见sambrook,j.,fritsch,e.f.,andmaniatis,t.(1989).molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition(plainview,newyork:coldspringharborlaboratorypress)。对hek293细胞(购自invitrogen)进行瞬时转染(pei，polysciences)并使用freestyletm293(invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含pd-1蛋白胞外区 的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白a亲和层析柱(购自gehealthcare)，同时用紫外(uv)检测仪监测紫外吸收值(a280nm)的变化。上样后用pbs磷酸盐缓冲液(ph7.2)清洗蛋白a亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1m甘氨酸盐酸(ph2.5)洗脱，收集从蛋白a亲和层析柱上洗脱下来的带hfc标签的pd-1蛋白(pd1-hfc)，用pbs磷酸盐缓冲液(ph7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的pd-1胞外区蛋白(pd1-hfc)蛋白。pd-l1胞外区蛋白(pd-l1-hfc)和pd-l2胞外区蛋白(pd-l2hfc)的制备和生物素标记pd-l1胞外区蛋白(pd-l1-hfc)的制备方法与上述pd1-hfc的制备方法相同，其中pd-l1胞外区蛋白的氨基酸序列信息参见uniprot数据库，编号q9nzq7.1。pd-l1-hfc的生物素标记方法为：将所得pd-l1-hfc与生物素化试剂反应既得。所述生物素化试剂购自sigma，商品号b3295；与生物素化试剂反应的操作步骤请参见该生物素化试剂的说明书。所得生物素标记的pd-l1胞外区蛋白命名为：pd-l1-ecd。pd-l2胞外区蛋白(pd-l2-ecd)的制备方法和生物素标记方法与所述pd-l1-ecd的制备方法相同，其中pd-l2胞外区蛋白的氨基酸序列信息参见uniprot数据库，编号q9bq51。所得生物素标记的pd-l2胞外区蛋白命名为：pd-l2-ecd。将所得pd-1胞外区蛋白(pd1-hfc)用pbs稀释到终浓度1.0μg/ml，然后以100μl每孔加到96孔elisa板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板2次，加入封闭液[pbs+0.01％(v/v)tween20+1％(w/w)bsa]室温封闭2.5小时。倒掉封闭液，每孔先加入实施例3所得的纯化的pd-1单克隆抗体待测样品50μl，再分别加入生物素标记的pd-l1胞外区蛋白(pd-l1-ecd)以及生物素标记的pd-l2胞外区蛋白(pd-l2-ecd)每孔100微升，混匀后37℃孵育2小时后，用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板3次。加入hrp(辣根过氧化物酶)标记的亲和素(购自sigma)稀释液每孔100微升，37℃孵育2小时后，用洗板液[pbs+0.01％(v/v)tween20]洗板3次。加入tmb底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0nhcl)100μl 每孔。用elisa读板机(spectramax384plus,moleculardevice)读取a450nm数值。所得实验结果表明，本发明提供的抗人pd-1单克隆抗体能有效封闭pd-1受体与其配体pd-l1和pd-l2的结合，具有较好的生物活性以及选择阻断性，具有制备抗肿瘤药物的潜力。实施例7淋巴细胞刺激实验检测pd-1抗体阻断pd-l1或pd-l2对t淋巴细胞的抑制淋巴细胞刺激实验检测pd-1抗体阻断pd-1蛋白与其配体pd-l1和pd-l2的结合从而解除其对t淋巴细胞活性的抑制。(一)ficoll分离全血获取外周血单核淋巴细胞pbmc。将新鲜获取的全血用磷酸缓冲液pbs以1:1的体积比例稀释得稀释后的全血，用无菌吸管轻轻将稀释后的全血铺平在ficoll液面(购自gehealthcare)，ficoll与稀释后的全血的体积比为3:4，避免震荡混匀，以400g转速室温梯度离心45分钟，离心后的离心管分为三层，上层为血浆，中间乳白色分层即为单核淋巴细胞，用无菌吸管轻轻吸取中间层细胞，收集至新的离心管，用pbs磷酸缓冲液稀释至三倍体积，150g转速室温离心8分钟，弃上清。将淋巴细胞用pbs磷酸缓冲液重悬至15ml，重复前面步骤取出血小板，最后将淋巴细胞重悬至15ml含有10％胎牛血清的多组份rpmi1640培养基(购自invitrogen)备用，即为外周血单核淋巴细胞pbmc，所述百分比为质量百分比。(二)pbmc刺激实验为构建pdl1和anti-cd3单链抗体在细胞膜上共表达的chok1或293f的稳定细胞株，构建了含编码pd-l1全长蛋白的核苷酸序列的质粒pires-puro-pd-l1；为使anti-cd3(okt3)(参见kipriyanovetal.1997,peds10:445-453)嵌合的scfv能锚定在细胞膜上，将该scfv与mousecd8a(ncbiaccessionno:np_001074579.1)的c端113-220氨基酸序列连接，构建成质粒pires-os8。(质粒pires-puro-pd-l1和质粒pires-os8的制备方法参见joesambrook，molecularcloning:alaboratorymanual)。将上述质粒pires-puro-pd-l1和质粒pires-os8共同转染chok1和293f细胞，按前述的质粒转染细胞的方法制备稳定传代细胞株chok1-pdl1/os8和稳定传代细胞株293f-pdl1/os8，并将两者作为t淋巴细胞刺激因子。使用前，将t淋巴细胞刺 激因子chok1-pdl1/os8和293f-pdl1/os8用10μg/ml丝裂霉素，37℃处理3小时。同时配制等体积比稀释的待测实施例3所得的纯化的pd-1抗体，得待测样品溶液。将外周血单核淋巴细胞pbmc以8×104个细胞150微升每孔铺至96孔细胞培养板，然后将所述的待测样品溶液加入培养板，室温培养20分钟，最后加入t淋巴细胞刺激因子chok1-pdl1/os8或293f-pdl1/os8，每反应孔中含有50微升6×103个t淋巴细胞刺激因子，保证每个反应孔200μl体积，将反应板于37℃、5％co2培养箱培养48小时后收集上清，得细胞上清液，于-20℃冻存，所述百分比为体积百分比。(三)细胞上清中细胞因子伽马干扰素(ifn-γ)或白介素il-2酶联免疫吸附检测。细胞上清中细胞因子伽马干扰素(ifn-γ)或白介素il-2酶联免疫吸附检测使用r&dsystem相关检测试剂盒humanifn-gammaquantikin(sif50)和quantikineelisahumanil-2检测试剂盒(s2050)，并按照说明书操作。除待测样品外的所有检测试剂均由检测试剂盒提供。细胞上清中细胞因子伽马干扰素(ifn-γ)或白介素il-2酶联免疫吸附检测采用双抗夹心elisa试剂盒(购自r&dsystems)。实验操作严格按照试剂盒说明书要求，所有检测试剂均由试剂盒提供。具体实验简述如下：将ifn-γ或il-2多克隆抗体包被于elisa微孔板上，将本实施例步骤(二)获得的细胞上清液作为待测样品，加入标准品和待测样品室温孵育3小时。每孔加入400微升洗液，重复洗板6次；再加入抗人ifn-γ或il-2的辣根过氧化物酶标抗体，室温孵育2小时，与微孔板上的ifn-γ或il-2形成免疫复合物，清洗微孔；加入底物显色，避光室温45分钟，最终加入终止液，用酶标仪测定a450nm吸光度。检测pd-1单克隆抗体在pbmc刺激实验中对ifn-γ分泌的影响。所得结果表明：在pbmc淋巴细胞刺激试验中本发明所得pd-1单克隆抗体可使pbmc的ifn-γ分泌增强，有效增强免疫功能，降低肿瘤免疫逃避的可能性，该抗人pd-1单克隆抗体具有制备抗肿瘤药物的潜力。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12