一种嵌段聚合物、含有其的药物载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种药物载体，具体涉及一种嵌段聚合物、含有其的药物载体及其制备方法和应用。

背景技术：

癌症即恶性肿瘤，是由于人体细胞的正常增殖机制被破坏，导致细胞恶性增殖，人体代谢失衡，组织和器官的结构与功能受损，最终患者会因器官衰竭而死亡。而随着经济社会发展和人口的老龄化，癌症成为发达国家和发展中国家人体健康的头号杀手，其中乳腺癌、肺癌、直肠癌在发展中国家发病率最高。目前，对于癌症的预防与治疗主要通过早期的诊断和治疗，烟草控制，以及疫苗的使用(肝癌、宫颈癌)等，同时向大众不断普及癌症预防与控制知识也能很大程度的减轻癌症带来的经济与社会负担。

癌症目前的治疗方式主要是手术并配合放射治疗与化学治疗。在传统的癌症治疗中，药物治疗是主要的治疗方式之一，即化疗。化疗是通过对患者进行全身或者局部给药，实现对恶性增殖细胞的抑制并杀死肿瘤细胞。化疗药物的种类主要有烷化剂(卡氮芥、环磷酰胺)，抗代谢药物(吉西他滨、卡莫氟)，抗肿瘤抗生素(阿霉素、吡喃阿霉素)，抗肿瘤动植物成分药物(紫杉醇、羟基喜树碱)，抗肿瘤激素类药物(他莫昔芬、阿他美坦)及一些杂类如顺铂、乐沙定等。但是，传统抗癌药物的作用机理是根据肿瘤细胞恶性增殖、代谢旺盛的特性对其生长进行抑制并达到杀死癌细胞的目的，这一性质导致此类药物不仅抑制癌细胞增殖，对正常的组织细胞生长也会产生抑制作用。因此，针对这一问题，为了提高对癌细胞的抑制效果并降低对正常细胞的伤害，能够靶向作用的药物载体成为药剂学研究的一个热点。

靶向药物转运系统(targetdrugdeliverysystem，tdds)包括作为药物载体的脂质体、乳剂、微囊和微球、纳米囊、或纳米球等，其功能是将药物靶向运输到作用部位并富集停留一段时间，从而实现药效的提升，降低药物的生物毒性。peg-plga嵌段共聚物作为制备纳米粒子载体的原料应用前景广阔，但由于peg主链上缺少易于功能化修饰的官能团，使得其作为药物载体的应用受到了一定限制。聚[n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺](phpma)作为水溶性高分子聚合物，生物毒性低且具有优良的生化性能和良好的可功能化性，通过自身的羟基 反应或者与其他功能性单体共聚合的方法可以制备含有不同功能基团的聚合物；大分子量的phpma具有epr(增强的渗透和滞留)效应，有利于其在肿瘤部位的聚集，可替代peg作为聚合物材料的亲水嵌段。但是，由于目前phpma载体的制备普遍采用普通自由基聚合，制备所得的聚合物分子量不可控，且分子量分布很宽，会对载体的epr效应以及药物的释放产生严重影响，进一步则会影响到药物对肿瘤的治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种嵌段聚合物、含有其的药物载体及其制备方法和应用。

本发明提供一种嵌段聚合物，其聚合单体包括第一单体和第二单体，所述第一单体为交酯或内酯中的一种或多种，所述第二单体为(甲基)丙烯酸酯类化合物或(甲基)丙烯酰胺类化合物中的一种或多种，所述嵌段聚合物以r-oh作为引发剂引发第一单体开环聚合(rop)，然后以所得的端基为r基团的聚合物作为大分子引发剂引发第二单体的进一步聚合而得；其中，r为具有可逆加成断裂转移(raft)或原子转移自由基(atrp)聚合活性的基团。

根据本发明，所述r-oh为下述式(i)～式(iii)所示化合物的一种：

其中，r1为具有raft聚合活性的烷基二硫代酯基、芳基二硫代酯基、烷基三硫代碳酸酯基、芳基三硫代碳酸酯基、烷基磺酸酯基、芳基磺酸酯基、烷基二硫代氨基甲酸酯基或芳基二硫代氨基甲酸酯基；

r2为r1、具有atrp引发活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基团、或r4-co-nh-r3-；

r3为-gflg-、-gplgiagq-或-gplgiagqkkkkkkkk-等多肽；

r4为r1、或者具有atrp引发活性的含氯原子(cl)或溴原子(br)的基团。

优选地，r1中，烷基为c8-16烷基，优选为c12烷基；芳基为苯基或萘基，优选为苯基。

优选地，r1为苯基二硫代酯基或者十二烷基三硫代碳酸酯基。

优选地，所述含氯原子(cl)或溴原子(br)的基团例如为2-溴异丙基、2-氯异丙基、 2-氯乙基、2-溴乙基、2-氯丁基或2-溴丁基。

优选地，r2为苯基二硫代酯基、十二烷基三硫代碳酸酯基或2-溴异丙基。

优选地，所述交酯为丙交酯(la)或乙交酯(ga)；所述内酯为己内酯(cl)。

优选地，所述(甲基)丙烯酸酯类化合物或(甲基)丙烯酰胺类化合物为(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺或n-(羟基烷基)(甲基)丙烯酰胺。优选地，n-(羟基烷基)(甲基)丙烯酰胺中的烷基为c1-6烷基，进一步优选为c2-4烷基，例如为丙基。更优选地，n-(羟基烷基)(甲基)丙烯酰胺为n-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(hpma)。

根据本发明，所述聚合物的通式如式(iv)所示：

式(iv)中，r’可为r1、氯原子(cl)或溴原子(br)；x可为-c(ch3)(cn)ch2ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)och2ch2-s-s-ch2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gflg-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(cn)ch2ch2c(o)nhgplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagq-c(o)och2ch2-、-c(ch3)(ch3)c(o)nh-gplgiagqkkkkkkkk-c(o)och2ch2-等非响应性、还原响应性或酶响应性连接键；y可为-c(ch3)-、-ch2-、-(ch2)5-中的一种或多种(如前两种)；m为5000-20000，n为1000-20000。

根据本发明，所述聚合物的通式如式(v)所示：

式(v)中，m为5000-20000，n为1000-20000。

根据本发明，其中第二单体部分的摩尔含量为20mol％-80mol％。

根据本发明，所述嵌段聚合物为两亲性嵌段共聚物，其数均分子量为6000～40000，分子量分布指数pdi＜1.2。其中疏水段分子量为1000-20000，例如分别为2000、5000、10000、20000，亲水段(如phpma)分子量为5000-20000，例如分别为5000、10000、20000。

本发明提供一种制备上述嵌段聚合物的方法，其包括以下步骤：

(1)以r-oh作为引发剂引发第一单体开环聚合，然后

(2)以所得的端基为r基团的聚合物作为大分子链转移剂引发第二单体的进一步聚合，得到所述嵌段聚合物；

其中，r为具有可逆加成断裂转移(raft)或原子转移自由基(atrp)聚合活性的基团，所述第一单体为交酯或内酯中的一种或多种，所述第二单体为(甲基)丙烯酸酯类化合物或(甲基)丙烯酰胺类化合物中的一种或多种。

根据本发明，所述引发剂r-oh，以4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇为例，合成步骤可细分为两步，首先将十二烷基硫醇与二硫化碳以及对甲苯磺酰氯反应合成双十二烷基双三硫代碳酸酯，然后通过双十二烷基双三硫代碳酸酯与4，4’-偶氮双(4-氰基戊醇)反应制备4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-氰基戊醇。

根据本发明，所述步骤(1)具体为：在惰性气体(如氩气)环境中，加入溶剂、r-oh引发剂、催化剂和第一单体，开环聚合，得到端基为r基团的聚合物，也即大分子链转移剂。

优选地，步骤(1)中，所述溶剂选自三氯甲烷、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺、甲苯或二甲基亚砜等。所述催化剂为4-二甲氨基吡啶(dmap)、7-甲基-1，5，7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(mtbd)、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(dbn)、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)或1，5，7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯(tbd)等。

优选地，第一单体为交酯时，所述催化剂为dbu；第一单体为内酯时，所述催化剂为 tbd。

优选地，步骤(1)中，所述反应的反应温度为30～60℃，优选40～50℃，更优选45℃；反应时间为30-70分钟，优选40-60分钟，更优选45分钟。

优选地，步骤(1)中，所述第一单体与r-oh引发剂的摩尔比为50～150∶1，优选地80～120∶1，更优选100∶1。所述第一单体与催化剂的摩尔比为500～1500∶1，优选地800～1200∶1，更优选1000∶1。

根据本发明，所述步骤(2)具体为：在惰性气体(如氩气)环境中，加入溶剂、上述的大分子链转移剂、第二引发剂和第二单体，进行可逆加成断裂转移(raft)或原子转移自由基(atrp)聚合反应，得到本发明的两亲性嵌段聚合物。

优选地，步骤(2)中，所述溶剂为二甲基亚砜。所述第二引发剂为4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)

优选地，步骤(2)中，所述raft或atrp聚合反应的反应温度为50～90℃，优选60～80℃，更优选70℃；反应时间为12～36小时，优选20～30小时，更优选24小时。

优选地，步骤(2)中，将raft或atrp聚合反应所得反应液浓缩后于沉淀剂(如异丙醇)中沉淀除去未反应的单体即可得到纯化的两亲性嵌段共聚物。

本发明提供一种药物载体，其含有上述聚合物。

根据本发明，所述聚合物制备成聚合物纳米粒子，含有聚合物纳米粒子的载体可以进行被动靶向给药，具体的是长循环抗肿瘤靶向药物载体。

本发明还提供一种药物组合物，其含有上述药物载体。

本领域技术人员可以理解，含有本发明聚合物的药物载体能够递送的药物并不受限制，各种药物都可以使用本发明的药物载体来递送。根据本发明的一个方面，本发明的药物载体可以用来递送需要缓释或者控释的药物，包括但不限于抗肿瘤药、抗感染药、激素类药物等，所述抗肿瘤药物包括但不限于抗肿瘤大分子，如具有抗肿瘤能力的蛋白质、多肽、质粒dna、sirna等，抗肿瘤小分子如7-乙基-10-羟基喜树碱(sn38)、紫杉醇(ptx)或阿霉素(dox)等。

本发明进一步提供所述聚合物作为药物载体(特别是抗肿瘤药物被动靶向药物载体)的应用或作为荧光指示剂载体的应用。

本发明的有益效果有：

本发明采用以r-oh作为引发剂的开环聚合(rop)以及可逆加成断裂转移(raft)或原子转移自由基(atrp)聚合的方法，通过两步简单、高效的合成出本发明的两亲性嵌段共聚物；而且该反应催化效率极高，较传统的辛酸亚锡催化所需时间大大缩短。另外，相较于传统的普通自由基聚合所制备的聚合物分子量不可控且分子量分布较宽，通过本发明方法制备的两亲性嵌段聚合物分子量组成可调，分子量可控，分子量分布窄(＜1.2)。

本发明的嵌段聚合物制备的药物载体，能够有效延长药物在血液中的循环时间，并还可以通过主动靶向或被动靶向作用定向富集至肿瘤病灶部位，此外，与传统的聚乙二醇修饰的纳米粒子相比较能够减轻血液加速清除效应，减轻多次给药过程中药物的损失和对正常器官的毒副作用。

附图说明

图1为本发明提供的两亲性嵌段共聚物以pdlla-b-phpma为例的合成路线示意图。

图2是本发明方法制备的pdlla的反应动力学分析曲线。

图3是本发明制备的pdlla的gpc曲线。

图4是本发明制备的pdlla-b-phpma的gpc曲线。

图5是本发明制备的pdlla-b-phpma的¹hnmr谱图。

图6是本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子随时间在小鼠巨噬细胞raw264.7内吞噬量变化的clsm图。

图7是通过流式细胞仪检测得到的本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子在小鼠巨噬细胞raw264.7内的吞噬量。

图8是本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子与pdlla-b-peg纳米粒子作为药物载体第一次给药后的血液清除实验。

图9是本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子与pdlla-b-peg纳米粒子作为药物载体第二次给药后的血液清除实验。

图10是本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子与pdlla-b-peg纳米粒子两次给药24小时后荧光强度之间的差异。

图11是本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子在小鼠体内分布的活体成像图片；其中，在活体或器官中黑色部分为荧光信号最强，白色部分荧光信号最弱。

具体实施方式

如上所述，本发明公开了一种嵌段聚合物和包含该聚合物的药物载体。本发明的嵌段聚合物能够有效延长药物在血液中的循环时间，因而可以作为缓释药物的载体使用；其次，本发明的嵌段聚合物还可以通过主动靶向或被动靶向作用定向富集至肿瘤病灶部位，因而可以作为长循环抗肿瘤靶向药物载体使用。根据应用要求，本发明的嵌段聚合物可通过物理包埋的方式作为抗肿瘤药物载体包埋疏水性药物，通过制备的嵌段聚合物纳米粒子的尺寸效应以及肿瘤组织的增强渗透与滞留效应(enhancedpermeabilityandretention，epr效应)对肿瘤实现被动靶向给药。

本发明中，为验证phpma较peg的“隐身”性能差异，制备纳米粒子包载尼罗红作为荧光探针，通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm)观察小鼠巨噬细胞raw264.7对聚合物纳米粒子的吞噬量随时间的变化，并使用流式细胞仪定量检测各实验组中聚合物的吞噬量。其次，由于peg作为药物载体时具有加速血液清除(acceleratedbloodclearance，abc)效应，为了验证phpma的引入对载药体系abc效应的缓解，分别制备pdlla-b-peg和pdlla-b-phpma的纳米粒子包载cy7.5，二次给药后考察药物载体在小鼠血液中的清除速率。再有，为验证该嵌段聚合物的生物分布及肿瘤靶向效果，制备纳米粒子过程中包载疏水性荧光染料cy7.5作为荧光探针，通过小动物活体成像系统观察嵌段聚合物进入小鼠体内后的循环及富集情况。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明所述数均分子量及分子量分布指数通过dmf相凝胶渗透色谱(gpc)以及¹h核磁共振光谱(¹hnmr)测量得到。

实施例1、4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊醇(cta-oh)的合成

取1000ml圆底烧瓶，将14.6gkoh加入450ml水中，再缓慢加入40.4g(48ml)十二烷基硫醇得到乳浊液状溶液，同时缓慢加入0.8g甲基三辛基氯化铵和14.4g(12.06ml)cs2的混合溶液，观察到溶液由土黄色转变为黄色最终为橙色。室温反应1小时后于冰盐浴(nacl) 中冷却至-5℃，缓慢加入20g对甲苯磺酰氯，保持-5℃条件反应2小时后于45℃水浴中反应45分钟生成橘色油状产物，冰水浴冷却1小时形成固体产物，抽滤并用冰水水洗数次除去水溶性杂质。再于丙酮中重结晶纯化：于61℃水浴中逐渐加丙酮，不断搅拌至溶解平衡即可，待冷却至室温后置于-20℃冰箱中过夜重结晶。将抽滤得到的晶体溶于150ml石油醚中，加无水naso4搅拌1小时除水，浓缩后通过柱层析分离纯化，流动相为石油醚，所得产物为双十二烷基双三硫代碳酸酯。取所得纯化产物5g与4.5g4，4`-偶氮双(4-氰基戊醇)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反应24小时，反应温度为95℃，得到的终产物再次通过柱层析分离纯化回收，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。

所述双十二烷基双三硫代碳酸酯的结构式如下：

实施例2、乙二醇单4-十二烷基三硫代酯基-4-氰基戊酸酯的合成

取实施例1中所制备双十二烷基双三硫代碳酸酯5g与5g4，4`-偶氮双(4-氰基戊酸)溶于150ml乙酸乙酯中冷凝回流避光反应24小时，反应温度为95℃，得到的终产物再次通过柱层析分离纯化回收，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。所得产物4.03g与3.1g乙二醇溶于50ml无水二氯甲烷，加入4.5g二环己基碳二亚胺(dcc)和0.2g4-二甲氨基吡啶(dmap)催化进行酯化反应，反应48小时后过滤除去产生的副产物二环己基脲，得到的终产物再次通过柱层析分离纯化回收，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1。

实施例3、乙二醇单2-溴异丁酸酯的合成

取9.3g乙二醇和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴将体系温度降到5℃，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加4.6g2-溴异丁酰溴，滴加完毕后反应24小时。待反应完毕后过滤除去产生的三乙胺氢溴酸盐，滤液分别用1％碳酸氢钠水溶液和纯水洗三次。收集有机相加入无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩除去有机溶剂得纯净产物。

实施例4、双羟乙基二硫化物单2-溴异丁酸酯

取12g双(2-羟乙基)二硫化物和2.02g三乙胺溶于100ml二氯甲烷中，采用冰水浴将体系温度降到5℃，使用恒压滴液漏斗缓慢滴加4.6g2-溴异丁酰溴，滴加完毕后反应24小时。待反应完毕后过滤除去产生的三乙胺氢溴酸盐，滤液分别用1％碳酸氢钠水溶液和纯水洗三次。收集有机相加入无水硫酸钠干燥后旋蒸浓缩除去有机溶剂得纯净产物。

实施例5、乙二醇单2-溴异丁酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸酯

取1.17ggflg四肽和0.33g三乙胺溶于10mln，n-二甲基甲酰胺(dmf)，冰浴条件下滴加0.3g二溴异丁酰溴，滴加完毕后室温反应24小时。反应完毕后真空浓缩至2-3ml，逐滴加入二氯甲烷中，过滤收集沉淀。将沉淀溶于dmf并重复在二氯甲烷中沉淀以除去原料和所产生的盐。取0.54g沉淀与0.12g乙二醇溶于10ml无水dmf中，加入0.56gdcc和0.1gdmap催化酯化反应的进行，反应24小时后过滤除去环己基脲(dcu)。加入50ml 二氯甲烷溶解产物，所得溶液用50ml纯水洗4次。收集有机相并加入无水硫酸钠干燥，过滤后旋蒸浓缩即得产物。其它基于多肽的r-oh的合成过程与本实施例相同。

实施例6、聚合物pdlla20000制备的反应动力学分析实验

提前将实验所需的反应瓶于120℃烘箱中烘干2小时除水，在45℃、氩气保护条件下进行下列操作。将烘干的反应瓶抽真空15min以确保没有空气，在通氩气的情况下取5gdlla单体加入反应瓶中。再于通氩气情况下取提前蒸馏纯化的三氯甲烷30ml于反应瓶中，搅拌溶解后加入2ml实施例1制备的cta-oh的chcl3溶液(25mg/ml)。在加入50mgdbu的同时开始计时，间隔2min取样一次，连续取1小时，所取样品于7ml异丙醇中沉淀，于冷冻离心机中8000r/min离心1分钟。所得沉淀于60℃真空烘箱中干燥，烘干后测gpc曲线，结果如图2所示，根据保留时间及产物分子量分布系数(pdi)的变化确定最佳反应时间为45分钟。根据确定的反应条件，改变投料比分别制备pdlla5000、pdllam000、pdlla20000聚合物，其gpc曲线如图3所示，分子量分布系数pdi分别为1.08，1.08和1.11，结果表明通过本发明的合成方法可以获得具有很好的单分散性的聚酯。

由于dbu催化效率极高，为确定最佳反应时间及反应温度，制备可控分子量且分子量分布较窄的聚合物，本实施例进行了反应动力学研究，确定在45分钟时聚合物达到设计的分子量并且分子量分布最窄。

实施例7、两亲性嵌段聚合物pdlla-b-phpma的制备

不同分子量的聚合物制备方法相同，只需要改变原料的投料比即可，在此列举两亲性嵌段聚合物pdlla10000-b-phpma5000的投料比例。取实施例6的pdlla10000聚合物2g，hpma单体1.2g，4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸)(v501)7mg，共同溶于15mldmso中。将反应瓶置于液氮中，待液体凝固后抽真空15min，再将反应瓶置于70℃水浴中通氩气磁力搅拌溶解，待完全溶解后再置于液氮中冷却，如此通氩气冻融三次以除去空气。最后置于70℃水浴反应24小时，将反应后的溶液于去离子水中透析2天除去未反应的单体，冻干得到纯化的产物，分别进行gpc和¹hnmr表征。

通过类似方法可以合成pdlla10000-b-phpma10000和pdlla10000-b-phpma20000，分别进行gpc和¹hnmr表征。

gpc和¹hnmr表征结果如图4、图5所示。图4可见，分子量分布系数pdi分别为1.05，1.11和1.12，这些结果表明所得聚合物的分子量分布具有很好的单分散性。图5为所制备的 聚合物的核磁谱图，从中可计算得到聚合物的实际组成，其结果与设计分子量非常接近，进一步表明了聚合过程的活性特征。

实施例8、不同分子量组成的pdlla-b-phpma纳米粒子的细胞吞噬实验

在制备pdlla-b-phpma纳米粒子的过程中加入尼罗红作为荧光探针，指示raw264.7巨噬细胞对聚合物纳米粒子的吞噬量随时间的变化。

将细胞均匀培养在6孔板培养皿中，培养一定时间后分别加入各个实验组尼罗红标记的pdlla-b-phpma纳米粒子溶液，计时分别于1小时及6小时将细胞固定并用dapi溶液(10μl，10μg/ml)染细胞核后通过聚焦激光扫描显微镜(clsm)来观察荧光图像，并使用流式细胞仪定量分析各实验组细胞的吞噬量，结果如图6、图7所示。

图6中，每栏图片从左到右依次为明场、dapi(细胞核)、dii(纳米粒子)、三个通道合并以及合并图片的局部放大图片。其中左侧为共培养1h所得的照片，右侧为共培养6h所得的照片。从图中可以发现随着时间延长，巨噬细胞对纳米粒子的内吞量增加，但是pdlla-b-phpma和pdlla-b-peg纳米粒子的内吞量要明显低于pdlla纳米粒子的细胞内吞量，证明phpma和peg能够有效抑制巨噬细胞对纳米粒子的摄取。与pdlla-b-peg相比，pdlla-b-phpma纳米粒子的细胞内吞量更低，体现出phpma聚合物的优势。另外，phpma的引入能够明显抑制巨噬细胞的摄取，其中phpma链段越长，巨噬细胞摄取量越低。与peg修饰的纳米粒子相比，phpma修饰纳米粒子的巨噬细胞摄取量更低，进一步证明了体系优异的“隐身”性能。

实施例9、包载cy7.5的pdlla-b-peg纳米粒子和包载cy7.5的pdlla-b-phpma纳米粒子的血液清除实验

在制备pdlla-b-peg纳米粒子和pdlla-b-phpma纳米粒子的过程中加入cy7.5作为荧光指示剂，分别制备了50nm粒径和100nm粒径的四种不同纳米粒子，设置每个实验组使用三只balb/c雌鼠(20±2g，5-6周龄)小鼠，通过尾静脉注射后，分别在0h，1h，3h，8h和24h通过眼部取血后，使用小动物活体成像系统(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍摄并进行数据处理，考察血液中荧光强度的改变情况。第一次给药实验结束后7天进行第二次给药，并重复上述实验，整理数据并作图，实验结果如图8-10所示。

图8为本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子及pdlla-b-peg纳米粒子作为药物载体，第一次给药后，在小鼠体内的清除速率曲线。图9为本发明制备的pdlla-b-phpma纳 米粒子及pdlla-b-peg纳米粒子作为药物载体，第二次给药后，在小鼠体内的清除速率曲线。图10为本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子及pdlla-b-peg纳米粒子作为药物载体，第一次给药24小时后，较第二次给药24小时后，在小鼠血液中荧光强度的差值。从结果中可以发现，在第一次给药之时，相同粒径的pdlla-b-peg纳米粒子和pdlla-b-phpma纳米粒子拥有相似的血液清除行为，且小粒径纳米粒子拥有更长的血液循环时间。然而，在第二次给药之后，我们可以发现pdlla-b-peg纳米粒子由于abc效应的存在使得血液清除速率明显加快。对于pdlla-b-phpma纳米粒子而言，第二次给药的血液清除速率与第一次相比也有一定程度的增加，但是从图10中的该变量来看，血液清除速率的降低程度要小于pdlla-b-peg纳米粒子，这也表明pdlla-b-phpma纳米粒子优异的体内长循环性能。

实施例10、包载cy7.5的不同分子量组成的pdlla-b-phpma纳米粒子的体内生物分布实验

实验所用小鼠为balb/c雌鼠(20±2g，5-6周龄)，并在实验前一周在小鼠背部右下侧构建4t1小鼠乳腺癌模型，每三只携带4t1乳腺癌模型的balb/c雌鼠作为一组进行pdlla-b-phpma纳米粒子的生物分布实验。cy7.5标记的各实验组聚合物粒子溶液通过尾静脉注射入小鼠体内并开始计时。分别在1，3，6，9，12，24，48小时通过小动物麻醉系统对小鼠进行麻醉，使用小动物活体成像系统(ivisspectrum，caliperlifesciences，usa)拍摄，根据荧光成像观察药物在小鼠体内的分布。48小时时间点的活体成像拍摄完成后，通过颈椎错位处死小鼠，解剖取出心脏，肺，肝脏，脾脏，肾脏及肿瘤再次使用活体成像系统拍摄荧光图像，根据所给出的荧光强度值，比较各实验组在小鼠体内的生物分布及肿瘤富集情况，结果如图11所示。

图11为本发明制备的pdlla-b-phpma纳米粒子包载cy7.5荧光探针后，通过尾静脉注射入小鼠体内后，观察随时间变化纳米粒子在小鼠体内分布的活体成像图片。结果表明，pdlla-b-phpma纳米粒子能够通过epr效应有效地富集到肿瘤组织部位，与pdlla-b-peg纳米粒子相比较，pdlla-b-phpma纳米粒子拥有相似的肿瘤组织靶向能力，上述结果进一步证明了pdlla-b-phpma纳米粒子良好的应用前景。