一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用的制作方法

本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术：

酯类水解酶(lipolytic enzymes)，包括酯酶(esterases)和脂肪酶(lipases)，广泛存在于动物、植物和微生物中。相较于动植物来源的酯酶，微生物来源的酯酶不仅种类多、来源广和作用高效，并且利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯类水解酶应用最多。酯类水解酶能够催化酯键的水解和合成。酯酶通常作用于水溶性的短链酯类，而脂肪酶则通常水解难溶的长链甘油三酯。酯类水解酶具有很好的区域选择性和立体选择性，能在非水相体系中发挥作用，同时不需要额外的辅因子帮助催化，且底物作用谱广等优点，这使得酯类水解酶广泛应用于洗涤剂、化妆品、造纸业、食品工业、农业和医药化学等领域。在这些工业应用中，酯类水解酶通常处于高温、高盐以及存在有机溶剂等不利条件中。因此，对热稳定的、耐盐的和/或耐有机溶剂的酯类水解酶的研究和开发逐渐成为研究热点。

一般来说，耐盐酶的蛋白表面存在大量带负电荷的酸性氨基酸，这些酸性氨基酸能够与溶剂中水合离子相互结合在蛋白表面形成一个保护性的水合盐离子网络，从而使酶蛋白在高盐条件下保持可溶和折叠状态，维持正常的结构和功能。因此，耐盐酶在需要高盐和低水活的工业应用中发挥重要作用。根据生化性质和氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶主要分为8个家族，第I-VIII家族。其中，第V家族以酯酶为主，这一家族酯酶在适冷菌、中温菌和嗜热菌中均有报道。第V家族酯酶在结构上类似于非酯类水解酶—环氧化物水解酶、脱卤酶和卤过氧化物酶等，后者也具有典型的α/β水解酶折叠结构。该家族已经有多个酶蛋白被表征，但是有关这一家族耐盐性的研究到目前为止还没有报道。

海洋是一个开放、多变、复杂的生态系统。海洋微生物不仅数量巨大，而且富含多种类群，其处于不同的温度、压力、盐浓度、营养物质等环境条件下，这为获取独特性质的具有工业潜力的新酶提供了巨大的来源。而宏基因组技术的应用，使得从各种环境资源中获取有工业潜力的新型酯类水解酶成为可能。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用。

一种海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因编码的海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶H8。

本发明海洋酯酶的基因H8来自南海深海沉积物样品S100宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5的大片段质粒fosmid DNA。通过构建P43-H5克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因H8的核酸序列。根据H8基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从P43-H5克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋酯酶H8的基因，构建了含海洋酯酶基因H8的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

测序结果表明海洋酯酶基因H8为一个含有918个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码305个氨基酸。因此酯酶H8是一个含有305个氨基酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶H8属于酯类水解酶第V家族。对纯化的海洋酯酶H8进行性质测定。结果表明该酶对短链的酯类(C4-C10)表现出较强的降解活性。最适pH为10.0，且在pH 6.0～9.0范围内稳定存在。最适酶活温度为35℃，且在20～40℃范围内保持超过80％的活力。H8在高浓度的NaCl中具有较高的酶活性，且对高浓度的NaCl表现出很好的耐受性，是耐盐酶。

上述海洋酯酶H8在水解碳链长度为4～10的短链酯类中的应用。

有益效果

1、本发明所述的海洋酯酶H8能在20～40℃和pH 6.0～9.0范围内保持很高的短链酯类降解酶活力，为广泛应用于工业生产中奠定了基础；

2、本发明所述的海洋酯酶H8在高盐中保持较高的酶活力，且对高盐表现出很好的耐受性，可以在需高盐和低水活的工业应用中发挥作用。

附图说明

图1、以海洋酯酶H8及其同源序列以及已知的酯类水解酶第V家族序列构建的系统发生树；

图2、通过PCR扩增克隆的编码海洋酯酶H8的基因片段的电泳图；

其中：泳道1为扩增的DNA片段，M泳道为DNA分子量标记(marker)；

图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的海洋酯酶H8电泳图；

其中：1、经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶H8电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；

图4、海洋酯酶H8的底物特异性分析；

图5、海洋酯酶H8的酶活温度曲线；

其中：A、温度对酶活性的影响，B、温度对酶稳定性的影响；

图6、海洋酯酶H8的酶活pH曲线；

其中：A、pH对酶活性的影响，B、pH对酶稳定性的影响；

图7、不同浓度的NaCl对海洋酯酶H8酶活性的影响曲线；

其中：A、NaCl对酶活性的影响，B、NaCl对酶稳定性的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：海洋酯酶H8编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：南海深海沉积物样品S100宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5。

具体步骤如下：

1.1亚克隆文库的构建

用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子P43-H5中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取1,500～5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及经碱性磷酸酶去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子P43-H5的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.2酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并以载体特异性引物M13F/R进行测序。用GeneMark软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子P43-H5上携带的酯酶基因序列H8，基因H8共918bp，其中含有一个918bp的开放阅读框架，其编码海洋酯酶H8，起始密码子位于1bp，终止密码子位于916bp，共编码305个氨基酸。获得的海洋酯酶H8编码基因H8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。海洋酯酶H8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.3海洋酯酶H8的序列分析

GenBank中，与海洋酯酶H8最相似的序列为来源于Alcanivorax sp.的α/β水解酶(WP_062817123.1)，序列相似性为99％。该蛋白是基于基因序列预测的，其生化性质尚未被研究。在已表征过的酯类水解酶中，与海洋酯酶H8最相似的序列为第V家族的酯酶Est16(AKN78217.1)，序列相似性为46％。为了确定海洋酯酶H8的进化位置，发明人从NCBI nr库中下载了酯酶H8的同源序列以及酯类水解酶第I家族和第V家族代表序列。通过CLUSTALX软件对获得的同源序列进行多重比对分析。选择JTT模型，用MEGA 6.0构建酯酶H8及其同源序列的进化树。

实施例2：海洋酯酶H8的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对H8基因序列进行扩增

(1)根据基因H8序列设计两条特异性引物：

H8F：GGGAATTCCATATGCAGTCTGGCACGGTGAG(SEQ ID NO.3)，用下划线标出的是NdeI酶切位点；

H8R：CCGCTCGAGCGCCACCGCCGGTTGCGCC(SEQ ID NO.4)，用下划线标出的是XhoI酶切位点；

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)以H8F和H8R为引物，以基因H8所在的fosmid为模板，用FastPfu DNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,000bp的DNA片段(如图2)。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)用限制性内切酶NdeI和XhoI对回收片段和质粒pET22b分别进行双酶切反应。回收片段酶切反应体系如下：

质粒pET22b酶切反应体系如下：

酶切反应置于37℃水浴中反应2个小时。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(5)将经过双酶切的H8基因片段连接到pET22b载体上。连接反应体系：

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，15℃过夜连接。

(6)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(7)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(8)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒，进行NdeI/XhoI双酶切，通过酶切验证正确的质粒送北京华大基因公司测序。

2.2重组表达载体pET22b-H8转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因H8在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上挑取单菌落，接于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(2)按1％(v/v)接种量转接到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(3)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续在20℃，110rpm摇床培养20h；

(4)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，8,000rpm离心5min，收集菌体；

(5)用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(6)将重新悬浮的菌液进行压力破碎；

(7)将破碎后的菌液12,000rpm离心45min，收集上清液；

(8)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(9)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得海洋酯酶H8的电泳纯酶(如图3)。用50mM的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液4℃透析3～4次。最后置于-20℃保存备用。

实施例3：海洋酯酶H8的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物，C2-C16(购自Sigma公司)。标准反应为：20μl 10mM pNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于35℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于35℃反应5min，立即加100μl 20％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定OD₄₀₅值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的对硝基苯酚(购自Sigma公司)来绘制。酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，海洋酯酶H8能高效降解C2-C12底物，其中对C6底物的降解能力最强，比活力为69U/mg(如图4)。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC6为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测海洋酯酶H8在0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃和60℃下的酶活。最高酶活定义为100％。结果表明该酶的最适酶活温度为35℃，其在20-40℃保留超过80％的高活力，且在0℃仍保留30％的活力(如图5A)。

温度稳定性分析：酶液分别在0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃和60℃下温育1h，然后取相同的酶量检测H8在35℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲体系中的残余活力。0℃酶活定义为100％。结果表明该酶在0-40℃条件下稳定存在，在超过50℃的条件下变得很不稳定(如图5B)。

3.3最适pH及pH稳定性分析

pNPC6底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～13.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定H8在35℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％，结果表明海洋酯酶H8是碱性酯酶，H8的最适pH为10.0(如图6A)。

pH稳定性分析：取4μl纯酶，加入116μl不同pH的缓冲液，以配制不同pH的H8，25℃温育1h后检测H8的残余活力，最高酶活定义为100％，结果表明H8在pH 6.0～9.0范围内表现出较强的稳定性(如图6B)。

3.4对NaCl的耐受性分析

用50mM Tris-HCl(pH 8.0)配制5M NaCl母液。在不同NaCl浓度下，酯酶活性的测定方法为：1ml反应体系中，包括20μl酶液，20μl 10mM pNPC6底物，一定量的5M NaCl至需要的终浓度，加入适量50mM Tris-HCl(pH 8.0)补足1ml。反应体系于35℃反应5min，加入50μl 0.4M三氯乙酸终止反应，再加入50μl 0.4M NaOH调回反应体系原始pH值。

NaCl对酶活性的影响：反应体系中分别含有终浓度为0、0.5M、1M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M和4.8M的NaCl，检测海洋酯酶H8在不同NaCl浓度条件下的酶活。最高酶活定义为100％。结果表明该酶是耐盐酶。H8酶活性不受4M NaCl的影响；当盐浓度高达4.5M时，H8仍保留高达80％的酶活力(如图7A)。

NaCl对酶稳定性的影响：取4μl纯酶，加入一定量5M NaCl至需要的终浓度，加入50mM Tris-HCl(pH 8.0)补足120μl，以配制含不同浓度NaCl的H8，0℃温育1h后检测H8的残余活力。以不加NaCl的酶活定义为100％。结果进一步表明该酶是耐盐酶。其在4.8M NaCl中温育1h后，仍保留高达80％的酶活性(如图7B)。

4.结果

通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子EPI300克隆子P43-H5中fosmid上所携带的酯酶基因H8的核苷酸序列。根据H8基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从P43-H5克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋酯酶H8的基因片段(图2)，构建了含海洋酯酶基因H8的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因H8含有一个918的开放阅读框架，其编码新型海洋酯酶H8，起始密码子位于1bp，终止密码子位于916bp，共编码302个氨基酸。将基因H8在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶H8(图3)。对纯化的酯酶H8进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在4～10个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图4)。其在20～40℃范围内保持很高的酶活力，且能在不高于40℃条件下稳定存在(图5)。最适pH为10.0，且在pH 6.0～9.0范围内稳定存在(图6)。H8酶活性不受NaCl浓度的影响，且在高达4.8M的NaCl中仍保持稳定(图7)，这表明海洋酯酶H8可以应用到高盐和低水活的工业生产中。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种海洋酯酶及其编码基因H8与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgcagtctg gcacggtgag cagtaacgga atcgagcttt tttacgagag tcgtggcccg 60

gaaaacgggg agcccattgt ctttgtcatg gggctctcgg cacagatggt gttctggccg 120

gaaccgttgc tggatatcct ggttgagcgt ggctatcggg tgatccgttt cgataaccgg 180

gatgtgggca aatccacccg cattcgcaaa ccgttcaagc aggggccgct ggtggcgttg 240

ctgcgttata ccgtggggat gtcggtagac agtgcctata ccctgcacga catggtggcc 300

gacaccgtgg ggctgctgga tgcgttgaac atcgaacggg cgcattttgt gggtgcctcc 360

atgggcggca tgatcagcca gttgatggcg gccacccatc ctgaccgggt gctgtcgctg 420

acctccatca tgtccagtaa caacagcccc tacctgccgt taccaaaacc cgccgccctc 480

aagaccctgg tggcccccgg agtgaaggtg gaaacggaag accagtttgt ggcgtttggt 540

ctggagatga tgggcaagct ggccggcacc ctgccccagg gccgtgacga actggaagcc 600

atgtatcggg agtgttgggc ccgcggcatc aacccgcgcg gtattcgcaa ccagttcctg 660

gccgtgctgg ccaccggtgc cctgaccaaa caccttaaac agatccgctg cccggccact 720

gtgatccacg gcggcgccga cccgctgatc cgtcccgccg gcggcaaggc ctccgcccgc 780

catattcgcg gtgccaagct ggtgattatt cccggcatgg gccacgactt cccgccgtca 840

gccattgacc ggattggtga cctgattgcg gagacggcgg ccagagcgaa ttcagtggcg 900

caaccggcgg tggcgtaa 918

<210> 2

<211> 305

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Gln Ser Gly Thr Val Ser Ser Asn Gly Ile Glu Leu Phe Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Arg Gly Pro Glu Asn Gly Glu Pro Ile Val Phe Val Met Gly Leu

20 25 30

Ser Ala Gln Met Val Phe Trp Pro Glu Pro Leu Leu Asp Ile Leu Val

35 40 45

Glu Arg Gly Tyr Arg Val Ile Arg Phe Asp Asn Arg Asp Val Gly Lys

50 55 60

Ser Thr Arg Ile Arg Lys Pro Phe Lys Gln Gly Pro Leu Val Ala Leu

65 70 75 80

Leu Arg Tyr Thr Val Gly Met Ser Val Asp Ser Ala Tyr Thr Leu His

85 90 95

Asp Met Val Ala Asp Thr Val Gly Leu Leu Asp Ala Leu Asn Ile Glu

100 105 110

Arg Ala His Phe Val Gly Ala Ser Met Gly Gly Met Ile Ser Gln Leu

115 120 125

Met Ala Ala Thr His Pro Asp Arg Val Leu Ser Leu Thr Ser Ile Met

130 135 140

Ser Ser Asn Asn Ser Pro Tyr Leu Pro Leu Pro Lys Pro Ala Ala Leu

145 150 155 160

Lys Thr Leu Val Ala Pro Gly Val Lys Val Glu Thr Glu Asp Gln Phe

165 170 175

Val Ala Phe Gly Leu Glu Met Met Gly Lys Leu Ala Gly Thr Leu Pro

180 185 190

Gln Gly Arg Asp Glu Leu Glu Ala Met Tyr Arg Glu Cys Trp Ala Arg

195 200 205

Gly Ile Asn Pro Arg Gly Ile Arg Asn Gln Phe Leu Ala Val Leu Ala

210 215 220

Thr Gly Ala Leu Thr Lys His Leu Lys Gln Ile Arg Cys Pro Ala Thr

225 230 235 240

Val Ile His Gly Gly Ala Asp Pro Leu Ile Arg Pro Ala Gly Gly Lys

245 250 255

Ala Ser Ala Arg His Ile Arg Gly Ala Lys Leu Val Ile Ile Pro Gly

260 265 270

Met Gly His Asp Phe Pro Pro Ser Ala Ile Asp Arg Ile Gly Asp Leu

275 280 285

Ile Ala Glu Thr Ala Ala Arg Ala Asn Ser Val Ala Gln Pro Ala Val

290 295 300

Ala

305

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gggaattcca tatgcagtct ggcacggtga g 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccgctcgagc gccaccgccg gttgcgcc 28