一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用的制作方法

本发明涉及一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

随着生物科技和食品工业的快速发展，功能性寡糖的研究与开发已成为国际生物技术领域的前沿方向，主要集中在天然植物和微生物来源的多糖，经酸碱等降解后制备低分子量的寡糖。寡糖产业现已成为一个应用于食品、医药、农业和化工等行业的新兴产业，市场规模大，全球寡糖年销售额超过5亿美元。人乳寡糖具有调节肠道菌群、增强免疫力、抗病毒感染、减少炎症以及促进婴儿大脑发育等生理作用，作为一类特殊结构的功能性寡糖类物质，参与婴儿的非免疫防御体系的增强，在婴儿营养保健方面必将发挥巨大的作用。

人乳寡糖及其类似物安全有效，不产生抗药性，以其作为原料来制备药物成为当前研发的又一大热点。目前关于人乳寡糖的功能与制备研究在我国仍未得到有效开展。通过化学合成法获得人乳寡糖，由于合成路线复杂以及糖苷供体昂贵，无法达到规模生产。目前对于寡糖的合成主要侧重于化学合成法，但此方法路线复杂，需要繁琐的保护和去保护方法。随着基因工程技术的快速发展，以及越来越多的糖苷酶基因和微生物代谢调控路线的不断解析，通过合成寡糖生产过程所需的多种酶来制备大量寡糖已成为可能。清洁的生物酶法合成，极大的推动人乳寡糖结构与活性的研究。人乳寡糖以岩藻糖基化寡糖为主，其中α-1,2-岩藻糖在被检人乳中占总寡糖的比例平均为73%。高效稳定的新型岩藻糖基化转移酶作用合成岩藻糖基化寡糖，在最大程度上减少了寡糖制备的生产成本，达到规模制备的目的。

岩藻糖基转移酶（Fucosyltransferase）属于糖基转移酶的酶家族中的一类己糖基转移酶，催化从核苷二磷酸岩藻糖将岩藻糖基转移至受体分子，通常是二磷酸鸟苷岩藻糖（GDP-岩藻糖）转移到包括寡糖、糖蛋白、以及糖脂的受体。基于岩藻糖的添加部位的不同，岩藻糖基转移酶被分类为：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、α-1,6-岩藻糖基转移酶、以及O-岩藻糖基转移酶。α-1,2-岩藻糖基转移酶广泛地存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、以及细菌中，但这些酶的大多不能在细菌系统中以活性形式表达，极大限制了寡糖的大规模合成制备。

目前只有来源于嗜热蓝绿藻（Thermosynechococcus elongatus）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）和大肠杆菌（Escherichia coli）等的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因，能在原核生物表达系统中得以活性表达。因此，发现高效稳定的新型α-1,2-岩藻糖基转移酶具有重要现实意义。本发明利用聚合酶链式反应技术从铁氧化菌Sideroxydans lithotrophicus基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶基因，利用大肠杆菌高效表达系统pET载体，对该基因进行表达，为岩藻糖基化人乳寡糖的合成奠定基础。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用，以达到能够高效合成岩藻糖基化寡糖的目的。

为了实现上述目的，本发明提供的一种岩藻糖基转移酶SlFucT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该岩藻糖基转移酶基因来源的铁氧化菌Sideroxydans lithotrophicus ES-1菌株，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏编号为ATCC700298。

编码所述岩藻糖基转移酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或编码氨基酸序列SEQ ID NO.2中所示蛋白质的核苷酸序列。

所述的基因的制备方法，设计引物，上游引物为：GATCCATATGGCGAACATGCGTGC，下游引物为：AAGGGATCCTTACAGACGAGCCGG；然后以公开的铁氧化菌Sideroxydans lithotrophicus ES-1（ATCC700298）基因序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_013959.1report=fasta&from=2906867&to=2907928&strand=true）为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得岩藻糖基转移酶基因序列。

一种重组表达载体，所述载体包含所述的岩藻糖基转移酶基因的核苷酸序列。

一种基因工程菌，所述基因工程菌由所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。

所述的岩藻糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：将权利要求5所述基因工程菌接种至LB培养基中培养，在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导下，表达岩藻糖基转移酶。

所述的岩藻糖基转移酶在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。

所述的基因工程菌在岩藻糖基化寡糖制备中的应用。

本发明的优点在于：本发明获得的岩藻糖基转移酶为新型酶，未见到从铁氧化菌来源的岩藻糖基转移酶，构建的产岩藻糖基转移酶工程菌株生物发酵产生的岩藻糖基转移酶以Galβ3-结构为受体，底物专一性强，为将其应用在酶法催化产生岩藻糖基转移酶中奠定了基础，通过其能以节约时间和成本的方式有效的制备人乳功能性寡糖。

附图说明

图1 重组质粒pET15b-slfuct物理图谱。

图2 岩藻糖基转移酶pET15b-slfuct重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图。

图3 岩藻糖基转移酶分离纯化SDS-PAGE图。

具体实施方式

实施例1

（1）将编码岩藻糖基转移酶slfuct的基因密码子优化并且通过Biomatik公司（USA）合成，并将岩藻糖基转移酶slfuct克隆到pBSK(+) Simple-Amp载体中。使用引物GATCCATATGGCGAACATGCGTGC和AAGGGATCCTTACAGACGAGCCGG从含有基因slfuct的pBSK(+) Simple-Amp中扩增slfuct的多核苷酸序列，PCR扩增条件如下，得到大小为1062 bp的目的基因片段（图1）。通过PCR法引入NdeI/BamHI的限制性酶切位点用于slfuct随后连接，将基因slfuct另外克隆到编码N端His-标记的表达载体pET15b（Novagen，UK）中，得到重组表达载体pET15b-slfuct（图2）。

PCR 扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30个循环，再72℃延伸10 min，4℃保温。反应体系中各成分用量（50 μL)：

设计引物，上游引物为：GATCCATATGGCGAACATGCGTGC，下游引物为：AAGGGATCCTTACAGACGAGCCGG。

（2）用上述将验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，按如下步骤进行：取大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min 融化，吸取50 μL感受态细胞与1-2微升pET15b-slfuct质粒混合，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入400-600 mL新鲜LB培养基，37℃、100rpm条件下复苏培养45min，之后取60-100 μL菌液涂布于含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB平板，37℃恒温培养箱培养14-18h后挑取单菌落，PCR鉴定重组子，证明pET15b-slfuct构建成功。

（3）挑取上述平板上的阳性转化子，转接到种子培养基中，置于37℃、200 rpm/min摇床上振荡培养16-18h，得种子液；再以1%（v/v）的接种量将种子液接种到发酵培养基中，于37℃振荡培养，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖（IPTG）苷诱导，IPTG终浓度0.1-0.3 mmol/L，于16-20℃诱导20-24 h，转速160-200 rpm。诱导时刻为发酵液OD₆₀₀为0.6-0.8。所述种子培养基和发酵培养基为LB培养基。

（4）诱导表达后，将发酵液于4000r/min、4℃离心1h收集菌体。将菌体用10mM pH7.0 Trsi-HCl缓冲液重悬后，以plus on 2s / off 3s的频率下超声5-7min中以破碎菌体；将破碎后液体于10000r/min、4℃离心30h去除细胞碎片后收集上清液，利用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性岩藻糖基转移酶，洗脱浓度为200 mM咪唑，SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况（图3），基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量41.4 kD基本一致。

（5）纯化后的重组酶slfuct，以GDP-岩藻糖为供体，Galβ1-3GalNAcαProN₃为底物，测定重组酶的岩藻糖基转移酶活性，高分辨质谱对产物进行分析，在M/Z：635.1(M-H)+有离子峰，反应合成岩藻糖基化寡糖Fucα-1,2Galβ1-3GalNAcαProN₃。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgaaca tgcgtgcgga ctggaaaatc cgttacgcaa actatattga acagggtgtg 60

tctgagaacg ctcgcttcga cctgacccac gcgattaacc gtgacgactc taactacccg 120

tactggatgc tgcgcgaacg tctgctgtcc tgcggtatcg aactgaacac cccggatatg 180

aacgctggtc gctccgttgt ttttgagctg cacatgaacg caatgcagcg tgaactggac 240

gtgccggctt tcgttctgct gatggaaact gctcagattt gcccgtctaa cgcgagccag 300

tctctgctgg cgcattatca gcgtatcttc acctggcgtg atgacctggt tgaccaccgc 360

cgttacatta agattaactt tccgaacaaa atccaccgtc tggatcagat cggttggcag 420

ggtcgtgacc gcctgtgttg cctgattgcg ggtaaccgtt gcccgaacca gcagtcttct 480

ctggacctgt atgcggagcg tgtgcgtact atccgttggt ttgagcacaa cgcaccggag 540

gcttttgacc tgtacggttc tggttgggag gtgtctccgc cgcgtttcgg caaaattggt 600

cgtctgtggc atcgtatggc gctgcgttgg gctcgcctga ccggttacaa agcgttttct 660

tcctaccgtg gtaaagttcc gagcaagctg gagactctga aaaagtaccg tttcgcggtg 720

tgctacgaaa acgttaaaga tctgccgggt tacatcactg agaagatttt tgactgcttc 780

ttcgcgggct gtgttccgat ctactggggt gcgccgaacg tttctgacta tatcccgcgt 840

gcgtgcttta tcgaccgtcg cgagtttagc tctcacgacg atctgtattg gtacctgact 900

cacatgaccg aggcgaacta ccaggcgtac cagattgctg ttcgtgactt cctggactcc 960

gcagcggcta aaccgtttat ggcggaagac ttcgctgaac agattacctg caccatcgtg 1020

tctgcgctgg atgacagcat ttgcgatccg gctcgtctgt aa 1062

<210> 2

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Asn Met Arg Ala Asp Trp Lys Ile Arg Tyr Ala Asn Tyr Ile

1 5 10 15

Glu Gln Gly Val Ser Glu Asn Ala Arg Phe Asp Leu Thr His Ala Ile

20 25 30

Asn Arg Asp Asp Ser Asn Tyr Pro Tyr Trp Met Leu Arg Glu Arg Leu

35 40 45

Leu Ser Cys Gly Ile Glu Leu Asn Thr Pro Asp Met Asn Ala Gly Arg

50 55 60

Ser Val Val Phe Glu Leu His Met Asn Ala Met Gln Arg Glu Leu Asp

65 70 75 80

Val Pro Ala Phe Val Leu Leu Met Glu Thr Ala Gln Ile Cys Pro Ser

85 90 95

Asn Ala Ser Gln Ser Leu Leu Ala His Tyr Gln Arg Ile Phe Thr Trp

100 105 110

Arg Asp Asp Leu Val Asp His Arg Arg Tyr Ile Lys Ile Asn Phe Pro

115 120 125

Asn Lys Ile His Arg Leu Asp Gln Ile Gly Trp Gln Gly Arg Asp Arg

130 135 140

Leu Cys Cys Leu Ile Ala Gly Asn Arg Cys Pro Asn Gln Gln Ser Ser

145 150 155 160

Leu Asp Leu Tyr Ala Glu Arg Val Arg Thr Ile Arg Trp Phe Glu His

165 170 175

Asn Ala Pro Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Gly Ser Gly Trp Glu Val Ser

180 185 190

Pro Pro Arg Phe Gly Lys Ile Gly Arg Leu Trp His Arg Met Ala Leu

195 200 205

Arg Trp Ala Arg Leu Thr Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser Tyr Arg Gly

210 215 220

Lys Val Pro Ser Lys Leu Glu Thr Leu Lys Lys Tyr Arg Phe Ala Val

225 230 235 240

Cys Tyr Glu Asn Val Lys Asp Leu Pro Gly Tyr Ile Thr Glu Lys Ile

245 250 255

Phe Asp Cys Phe Phe Ala Gly Cys Val Pro Ile Tyr Trp Gly Ala Pro

260 265 270

Asn Val Ser Asp Tyr Ile Pro Arg Ala Cys Phe Ile Asp Arg Arg Glu

275 280 285

Phe Ser Ser His Asp Asp Leu Tyr Trp Tyr Leu Thr His Met Thr Glu

290 295 300

Ala Asn Tyr Gln Ala Tyr Gln Ile Ala Val Arg Asp Phe Leu Asp Ser

305 310 315 320

Ala Ala Ala Lys Pro Phe Met Ala Glu Asp Phe Ala Glu Gln Ile Thr

325 330 335

Cys Thr Ile Val Ser Ala Leu Asp Asp Ser Ile Cys Asp Pro Ala Arg

340 345 350

Leu Glx

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatccatatg gcgaacatgc gtgc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagggatcct tacagacgag ccgg 24