斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用。

背景技术：

在机体的代谢调节过程中，胰岛素（insulin）起着重要的调控作用。胰腺一直被认为是胰岛素的重要产生器官，但最近的研究表明胰腺以外的其他器官也能够分泌胰岛素，胰岛素作为重要的激素，在机体的生长、细胞分化以及代谢方面发挥重要的功能。鱼类的胰岛素作为最早被发现的胰岛素的一种，在鱼类的摄食、生长、发育和糖脂代谢调节等多方面都发挥重要作用。胰岛素与受体结合后能够通过pi3k/akt，erk和stat/jak–stat信号通路来引发下游多种的生物学功能。

石斑鱼属鮨科（serranidae），石斑鱼属（epinephelus），为暖水性的大中型海产鱼类。石斑鱼营养丰富，肉质细嫩洁白，类似鸡肉，素有“海鸡肉”之称。石斑鱼又是一种低脂肪、高蛋白的上等食用鱼，被港澳地区推为我国四大名鱼之一，是高档筵席必备之佳肴。目前石斑鱼的饲料还是以动植物蛋白作为主要添加剂，然而动植物蛋白成本较高，如果能够提高石斑鱼对糖脂的利用，对生产成本会有很大的降低。但是，目前在石斑鱼人工养殖中尚未见利用insulin蛋白作为一种有效促进斜带石斑鱼对糖脂利用的饵料添加剂或促生长剂的报道。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种斜带石斑鱼insulin基因。

本发明的另一目的在于提供一种斜带石斑鱼insulin蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体。

本发明的另一目的在于提供上述表达载体转化的大肠杆菌重组菌株。

本发明的另一目的在于提供利用上述大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备得到的重组斜带石斑鱼insulin蛋白及其在制备海水鱼类促生长剂或饵料添加剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种斜带石斑鱼insulin基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

一种斜带石斑鱼insulin蛋白，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明首次克隆了斜带石斑鱼的insulin基因，并得到了3’utr和部分5’utr。克隆的方法是常规的基因克隆方法，利用同源物种的基因比对设计简并引物，经过pcr后得到中间片段，然后根据中间片段的序列分别设计两个5’race的下游引物和两个3’race的上游引物，再利用通用引物aap和auap进行5’和3’嵌套pcr得到了insulin的orf、5’utr和3’utr。最后设计克隆orf的引物，pcr后把得到目的基因连接到pcr2.1载体上，即得到pcr2.1-insulin；基因测序后获得斜带石斑鱼insulin基因的核苷酸序列，如seqidno:1所示。

一种含有上述斜带石斑鱼insulin基因的表达载体，所述表达载体可以是任意一种可高效表达斜带石斑鱼insulin基因的载体。

优选地，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。

更优选的，所述表达载体为大肠杆菌表达载体pet22b-insulin。

本发明构建的含有斜带石斑鱼insulin基因的大肠杆菌表达载体pet22b-insulin，是利用上述载体pcr2.1-insulin为模板，通过pcr方法合成带有酶切接头的斜带石斑鱼insulin基因，经酶切和分离纯化后，接入到已有的载体pet22b的相应酶切位点（即ecori和noti）之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体pet22b-insulin。

一种包含上述表达载体的重组菌株。

优选地，所述菌株为大肠杆菌重组菌株pet22b-insulin-bl21；该菌株能高效表达重组斜带石斑鱼insulin蛋白；该菌株是由上述含有斜带石斑鱼insulin基因的表达载体pet22b-insulin转化大肠杆菌bl21而得到的菌株，命名为pet22b-insulin-bl21。

斜带石斑鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用上述含有斜带石斑鱼insulin基因的大肠杆菌重组菌株pet22b-insulin-bl21，大量生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白。

另外，本发明还提供一种利用上述大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法，包括如下步骤：将上述大肠杆菌重组菌株接种在lb液体培养基中，于37℃、转速200转/分条件下培养至od600值达到0.5～0.8，然后加入iptg至终浓度为1mm，于37℃、转速200转/分条件下培养4h后，经5000×g离心10min收集菌体，超声破碎后经12000×g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼insulin蛋白。

本发明还请求保护由上述方法制备得到的重组斜带石斑鱼insulin蛋白；所述蛋白可提高海水鱼类对糖脂的利用，促进海水鱼类的生长。

本发明还请求保护上述insulin蛋白或重组斜带石斑鱼insulin蛋白在制备海水鱼类促生长剂和/或饵料添加剂中的应用。

一种促进海水鱼类生长的药剂和/或饲料，含有上述斜带石斑鱼insulin蛋白或重组斜带石斑鱼insulin蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次克隆获得斜带石斑鱼insulin基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌株在体外获得大量表达的重组斜带石斑鱼insulin蛋白，经研究该蛋白能显著抑制糖异生相关基因g6p和pepck的表达、显著促进脂肪合成相关基因acc1和fas的基因表达、显著促进生长相关基因igfi和igfii的基因表达，即该蛋白能促进斜带石斑鱼等海水鱼类对糖脂的利用和生长，可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或饵料添加剂，减少动植物蛋白的使用，降低生产成本。

附图说明

图1为实施例1中以斜带石斑鱼布氏体的反转录cdna为模板进行pcr扩增insulin中间片段产物的凝胶电泳分析图；其中泳道m为marker，泳道1为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照。

图2为实施例1中5'race和3'race的pcr电泳图；a为5'race第一轮产物的凝胶电泳图，其中泳道m为marker，泳道1、2、3为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照；b为5'race第二轮产物的凝胶电泳图，其中泳道m为marker，泳道1、2、3为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照；c为3'race第一轮产物的凝胶电泳图，其中泳道m为marker，泳道1、2、3为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照；d为3'race第二轮产物的凝胶电泳图，其中泳道m为marker，泳道1、2、3为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照；e为克隆insulinorf的产物的凝胶电泳图，其中泳道m为marker，泳道1、2、3为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照。

图3：a为实施例2中带酶切位点insulin的pcr扩增凝胶电泳分析图，其中泳道m为marker，泳道1为pcr扩增产物，泳道nc为阴性对照；b为实施例2中表达载体pet22b-insulin的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中泳道m为marker，泳道1为pet22b-insulinecori和noti双酶切，泳道2为pet22b-insulin未酶切。

图4：a为实施例4中重组菌株pet22b-insulin-bl21表达产物insulin蛋白的sds-page电泳分析图，其中泳道m为蛋白marker，泳道nc为阴性对照，泳道1为重组菌株pet22b-insulin-bl21表达产物；b为实施例4中重组菌株pet22b-insulin-bl21表达产物insulin蛋白纯化产物的sds-page电泳分析图，其中泳道m为蛋白marker，泳道1、2、3、4为insulin蛋白纯化产物；c为实施例4中重组菌株pet22b-insulin-bl21表达产物insulin蛋白纯化产物的westernblot鉴定图谱，其中泳道m为蛋白marker，泳道1、2、3、4为insulin蛋白纯化产物。

图5为应用例1中重组斜带石斑鱼insulin蛋白对斜带石斑鱼原代肝细胞糖脂代谢及生长相关基因的影响情况；a为糖异生相关基因g6p的表达水平；b为糖异生相关基因pepck的表达水平；c为脂肪合成相关基因acc1的表达水平；d为脂肪合成相关基因fas的表达水平；e为生长相关基因igfⅰ的表达水平；f为生长相关基因igfⅱ的表达水平；其中“*”表示p＜0.05；“**”表示p＜0.01；“***”表示p＜0.001。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

斜带石斑鱼insulin基因的克隆，包括以下步骤：

1、insulin基因中间片段的克隆

对已报道的尼罗罗非鱼（oreochromisniloticus），鲤鱼（cyprinuscarpio），红鳍东方鲀（takifugurubripes），青鳉（oryziaslatipes）中所获得的insulin序列进行比对，找到相对保守区域，设计克隆斜带石斑鱼insulin序列中间片段的一对简并引物，上游引物（seqidno:3）为5’-gghttcttctayavccccargag-3’，下游引物（seqidno:4）为5’-gttrcagtagttctssagstcra-3’；以斜带石斑鱼布氏体rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr反应后的凝胶电泳图见图1所示。

2、insulin基因5’race和3’race的克隆

根据已经获得的中间片段序列分别设计5’race和3’race各两条引物并利用通用引物auap和aap进行克隆。

5’race上游引物为：

aap（seqidno:5）：5’-ggccacgcgtcgactagtacgggggggggg-3’；

下游引物分别为：

r1（seqidno:6）：5’-cgatgcctcgcttcacca-3’；

r2（seqidno:7）：5’-ctccgccacctcgttct-3’；

3’race上游引物分别为：

f1（seqidno:8）：5’-ccctctgatgggtttcctc-3’；

f2（seqidno:9）：5’-ttcgcctacaaggaccaga-3’；

下游引物为auap（seqidno:10）：5’-ggccacgcgtcgactagtac-3’。

以斜带石斑鱼布氏小体rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr反应后的凝胶电泳图见图2中的a、b、c、d所示。

3、insulinorf的克隆

根据步骤1和2的结果，设计一对克隆insulinorf的引物，上游引物f-orf（seqidno:11）的核苷酸序列为5’-atggcggctctgtggctccagt-3’、下游引物r-orf（seqidno:12）的核苷酸序列为5’-tcagttgcagtagttctgcagg-3’，以斜带石斑鱼布氏体rna反转录后的cdna为模板做pcr。pcr条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃∞。经过pcr后把得到的产物与pcr2.1载体连接在一起，即为pcr2.1-insulin。pcr反应后的凝胶电泳图见图2中的e所示。基因测序后获得斜带石斑鱼insulin基因的核苷酸序列，如seqidno:1所示。

实施例2

含斜带石斑鱼insulin基因的大肠杆菌表达载体pet22b-insulin的构建，步骤如下：

1、带酶切位点的斜带石斑鱼insulin基因的合成

根据上述克隆到的斜带石斑鱼insulin基因的序列及限制性内切酶ecori和noti的识别序列以及保护碱基，设计合成一对特异性引物，上游引物f（seqidno:13）为5’-cggaattcacatcatcatcatcatcatgccacggcgccgcagc-3’，是在insulin基因的成熟肽序列前添加了ecori酶切识别位点和6×his标签；下游引物r（seqidno:14）为5’-atagtttagcggccgctcagttgcagtagttctg-3’，是在insulin基因成熟肽序列后添加了终止密码子及noti酶切识别位点。利用实施例1构建的pcr2.1-insulin为模板进行pcr反应，pcr反应条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；4℃∞。pcr扩增产物的电泳鉴定图见图3中a所示。

2、将步骤1的pcr产物用限制性内切酶ecori和noti双酶切后，酶切产物用e.z.n.a.^®gelextractionkit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化斜带石斑鱼insulin基因片段；载体质粒pet22b经限制性内切酶ecori和noti双酶切后分离纯化，与分离纯化斜带石斑鱼insulin基因片段混合，用toyoboligtionhigh连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌dh5a中，用lb平板筛选具ampicillin抗性的转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶ecori和noti双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与斜带石斑鱼insulin基因和表达载体pet22b大小相同，证明斜带石斑鱼insulin基因已克隆入大肠杆菌表达载体pet22b中，重组质粒（即表达载体）命名为pet22b-insulin。酶切分析图分别见图3中的b所示。

实施例3

能高效表达重组斜带石斑鱼insulin蛋白的大肠杆菌重组菌株pet22b-insulin-bl21的构建，步骤如下：

将实施例2中制备好的重组质粒pet22b-insulin用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，在含ampicillin的lb平板上于37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达重组斜带石斑鱼insulin蛋白的大肠杆菌重组菌株pet22b-insulin-bl21。

实施例4

一种利用实施例3所得大肠杆菌重组菌株生产重组斜带石斑鱼insulin蛋白的方法，包括如下步骤：

挑取大肠杆菌工程重组菌株pet22b-insulin-bl21单菌落接种在10mllb液体培养基中，于37℃、转速200转/分条件下培养过夜，然后按照1:100的比例接种于1llb液体培养基中，于37℃、转速200转/分条件下培养至od600值达到0.5～0.8，然后加入iptg使其终浓度为1mm，于37℃、转速200转/分条件下培养4h后，经5000×g离心10min收集菌体，超声破碎后经12000×g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼insulin蛋白。由该方法得到的insulin蛋白的表达量为25mg/l。

取3μl菌液加2×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑sds-page凝胶电泳，同时取阴性对照（空载质粒pet22b转化bl21后长出的单克隆培养后的菌液）按同样方法处理后进行sds-page凝胶电泳，sds-page凝胶电泳结果如图4中的a所示。将pet22b-insulin-bl21表达上清用novagen公司的his-bindresin进行纯化处理，得到纯化后的insulin蛋白，进行sds-page凝胶电泳，结果见图4中的b所示。

将重组斜带石斑鱼insulin蛋白采用免疫印迹（westernblot）方法进行鉴定。一抗为鼠抗his单克隆抗体（购自novagen公司），二抗为羊抗鼠igg-hrp（购自博士德生物工程有限公司）。westernblot鉴定结果见图4中的c所示。

应用例1

实施例4所得重组斜带石斑鱼insulin蛋白的功能研究：对斜带石斑鱼原代肝细胞糖脂代谢和生长相关基因的影响。

1、分离斜带石斑鱼原代肝细胞后，用加入10%fbs的含有酚红的l15培养基把细胞浓度调成5×10⁵细胞/ml，然后在24孔板中每孔加入1ml，放在25℃的生化培养箱中，培养过夜后，换成900μl的无fbs的l15培养基饥饿1h，然后向处理组中每孔分别加入100μl的浓度为100、1000、10000ng/ml的分离纯化后的重组斜带石斑鱼insulin蛋白，对照组加入等体积的无血清培养基，在25℃的生化培养箱中培养12h收集培养上清液用trizol（购自thermofisherscientific公司）裂解细胞后，完全收取裂解细胞后的裂解液。提取样品中的总rna并用m-mlv（购自thermofisherscientific公司）对rna进行反转录。用荧光定量pcr试剂盒（购自toyobo公司）在lightcycler480ii（购自罗氏公司）上进行荧光定量pcr反应，以18srrna作为内参，计算对照组和处理组之间糖脂代谢和生长相关基因的变化情况。

2、结果显示，用insulin蛋白处理原代肝细胞后能够显著的抑制糖异生相关基因g6p和pepck的表达；显著促进脂肪合成相关基因acc1和fas的基因表达；并且显著促进生长相关基因igfi和igfii的基因表达。各基因表达水平如图5所示。insulin蛋白对斜带石斑鱼的平均增重率、成活率、体长等均有显著的促进作用。

以上结果表明，insulin蛋白能够促进斜带石斑鱼对糖类和脂肪的利用和生长，可以用于制备适合海水鱼类使用的促生长剂或饵料添加剂。

序列表

<110>中山大学

<120>斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>351

<212>dna

<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

<400>1

atggcggctctgtggctccagtctgtctctctgctggtcttactggttgtgtcgtggccg60

agctctcaggccgccacggcgccgcagcacctgtgtggctctcacctggtggacgcgctc120

tacctggtctgtggggacagaggcttcttctacaaccccaagagagacgtggaccctctg180

atgggtttcctccctccaaaggtgggcggagcagcagcagcaggcggcgagaacgaggtg240

gcggagttcgcctacaaggaccagatggagatgatggtgaagcgaggcatcgtggagcag300

tgctgccaccgaccctgcaacatcttcgacctgcagaactactgcaactga351

<210>2

<211>116

<212>prt

<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

<400>2

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115

<210>3

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<212>dna

<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

<400>3

gghttcttctayavccccargag23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

<400>4

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<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

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<211>22

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<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

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<213>斜带石斑鱼(epinepheluscoioides)

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