的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3°C8小时，然后将过夜 后的溶液离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，将蛋白质浓度调节至质量百分数1 %， 得到粗提竹笋胰蛋白酶抑制剂。取5ml上样到葡聚糖凝胶G25柱，用超纯水洗脱，洗脱馏分 经浓缩成5ml，再经葡聚糖凝胶G50柱（2X93. 5cm)，用超纯水洗脱，洗脱馏分浓缩后，再经 二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50 (2. 5X21cm)(先用pH为6.O的0? 05MNaCl-0.OlM的 H3PO4缓冲液平衡），用0.lg/L-0. 3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0. 12-0. 15g/L的梯度洗 脱馏分，即得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，其含量如表1所示。采用BNPAN法进行胰蛋白酶抑 制剂活性检测：取一定量胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂样品（本实施例的纯化的胰蛋白酶抑 制剂）混合，再加入含 〇. 〇lmol/L的CaCl2O.lmol/LTris-HCl，pH8. 0 的缓冲液 3mL，37°C保 温5min，加入适量0. 025mol/L的BNPAN，再在37°C条件下温浴IOmin后，加入0. 5mL33%乙 酸以终止反应，410nm波长处测定光吸收值。以上实验条件下，与不加抑制剂的样品（本实 施例的纯化的胰蛋白酶抑制剂）的吸收值比较，加入抑制剂的样品每降低0. 1个A41tol的吸 收值为一个BSTI抑制活性单位（U)。经过检测，本实施例的纯化的胰蛋白酶抑制剂的活性 约为 4207IU/mg
[0015] 实施例2
[0016] 竹笋去皮用水清洗干净，切成约3X5cm小片，然后按竹笋：水质量体积比Ig:5ml 将切片的竹笋加入到水中，用混合器磨碎，再在90°C下反应30min，过滤，去渣取滤液，边搅 拌边向滤液中缓慢加入750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于7°C12小时，然后将过夜 后的溶液离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，将蛋白质浓度调节至质量百分数1 %， 得到粗提竹笋胰蛋白酶抑制剂。取5ml上样到葡聚糖凝胶G25柱，用超纯水洗脱，洗脱馏分 经浓缩成5ml，再经葡聚糖凝胶G50柱（2X93. 5cm)，用超纯水洗脱，洗脱馏分浓缩后，再经 二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50 (2. 5X21cm)(先用pH为6. 0的0? 05MNaCl-0.OlM 的H3PO4缓冲液平衡），用0.lg/L-0. 3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0. 12-0. 15g/L的梯 度洗脱馏分，即得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，其含量如表1所示。经过BNPAN法进行胰蛋白 酶抑制剂活性检测，本实施例的纯化的胰蛋白酶抑制剂活性为3524IU/mg
[0017] 实施例3:
[0018] 竹笋去皮用水清洗干净，切成约3X5cm小片，然后按竹笋：水质量体积比Ig:3ml 将切片的竹笋加入到水中，用混合器磨碎，再在70°C下反应15min，过滤，去渣取滤液，边搅 拌边向滤液中缓慢加入670g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于5°C10小时，然后将过夜 后的溶液离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，将蛋白质浓度调节至质量百分数1 %， 得到粗提竹笋胰蛋白酶抑制剂。取5ml上样到葡聚糖凝胶G25柱，用超纯水洗脱，洗脱馏分 经浓缩成5ml，再经葡聚糖凝胶G50柱（2X93. 5cm)，用超纯水洗脱，洗脱馏分浓缩后，再经 二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50 (2. 5X21cm)(先用pH为6. 0的0? 05MNaCl-0.OlM 的H3PO4缓冲液平衡），用0.lg/L-0. 3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0. 12-0. 15g/L的梯度 洗脱馏分，即得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，其含量如表1所示，纯度如图1所示。经过BNPAN 法进行胰蛋白酶抑制剂活性检测，本实施例的纯化的胰蛋白酶抑制剂活性为4525IU/mg。
[0019] 通过上述流程获得的结果如表1:
[0020] 表1 :实施例1-3纯化后的胰蛋白酶抑制剂的含量
【主权项】
1. 一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤： 将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比Ig 将切片的竹笋加 入到水中，然后磨碎，再在60-90 °C下反应3-30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中 加入600-750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3-7°C下8-12小时，然后离心，去掉上 清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝胶G25柱，用水洗脱，洗脱馏分经浓缩后再 经葡聚糖凝胶G50柱，用水洗脱，洗脱馏分再经二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50,用 0. lg/L-0. 3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0. 12-0. 15g/L的梯度洗脱馏分，即得到胰蛋白 酶抑制剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将沉淀物再溶解于水中是将沉淀 物再溶解于水中使蛋白质浓度为质量百分数1%。
【专利摘要】本发明公开了一种用竹笋提取胰蛋白酶抑制剂的方法。它是将竹笋去皮用水清洗干净切片，然后按竹笋：水质量体积比1g：1-5ml将切片的竹笋加入到水中，然后磨碎，再在60-90℃下反应3-30min，过滤，去渣取滤液，边搅拌边向滤液中加入600-750g/L的硫酸铵溶液，直至溶液澄清，置于3-7℃下8-12小时，然后离心，去掉上清液，将沉淀物再溶解于水中，然后经葡聚糖凝胶G25柱，用水洗脱，洗脱馏分经浓缩后再经葡聚糖凝胶G50柱，用水洗脱，洗脱馏分再经二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50，用0.1g/L-0.3g/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集0.12-0.15g/L的梯度洗脱馏分，即得到胰蛋白酶抑制剂。本发明可开发出高附加值的竹笋产品，提高竹笋加工业的经济效益，提高资源利用效率，带动竹产业发展和农村经济的繁荣。
【IPC分类】C07K14-81, C07K1-16
【公开号】CN104558158
【申请号】CN201410787236
【发明人】余能富, 王玉, 王小东, 贺磊, 黄慧
【申请人】江西省林业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月17日