关专利。
[0011] 例如，美国Medarex公司及日本OnoPharmaceutical公司在专利号为N〇8008449 美国发明专利（发明人KormaAJ等，发明名称：Humanmonoclonalantibodiesto programmeddeathI(PD-I)andmethodsfortreatingcancerusinganti-PD-l antibodiesaloneorincombinationwithotherimmunotherapeutics)中公开了由转 染CHO细胞及其表达的含全长或含胞膜外区人ro-i蛋白作为混合抗原，交叉免疫具人免疫 球蛋白（Ig)转基因的工程小鼠（HuMbMoues)中筛选获得的多个抗人H)-l抗体的杂交瘤 及其分泌的抗体蛋白、编码抗体蛋白的核苷酸序列，及该抗体用于ro-i蛋白检测及治疗肿 瘤等疾病的应用。
[0012] MerckSharp&Dohme公司在专利号为No8168757美国发明专利（发明人 FinnefrockAC等，发明名称F1D-Ibindingproteins)中，也公开了其由含F1D-I基因的DNA 分子免疫小鼠后筛选获得的多个抗人ro-i抗体的杂交瘤及其抗体蛋白、其编码核苷酸序 列，及该抗体用于通过增强机体内免疫功能而达到治疗肿瘤及感染性疾病的目的。
[0013] Genentech公司在专利号为No8217149的美国发明专利(发明人IrvingB等，发 明名称Anti-PD-Llantibodies,compositionsandarticlesofmanufacture)中，公开 了从噬菌体抗体展示基因库（phage-display)中筛选扩增获得的多个抗人F1D-Ll抗体的抗 体蛋白片段、其编码核苷酸序列及其用途。
[0014] 美国Weythe(惠氏）公司及Medimmune(免疫医疗有限公司）在其中国专利申请 号为201010170022. 4、发明名称为"抗H)-l抗体及其用途"的专利文件中披露了从噬菌粒 scFv基因展示库筛选获得的抗人H)-l抗体的片段、其编码DNA序列及该类抗体作为药物成 分，用于治疗包括自身免疫病、变态反应、癌症等免疫系统相关疾病的应用。
[0015] 美国Medarex(米德列斯）公司则在其一国际PCT/US2006/026046进入中国的申 请号为200680028238. 9、发明名称为"抗程序性死亡配体I(TO-Ll)的人单克隆抗体"的专 利文件中披露了其从免疫小鼠中筛选获得的高亲和力特异结合人ro-Li的单克隆抗体、其 编码DNA序列及其用该类抗体用于治疗包括癌症和传染病在内的各种疾病的方法。
[0016] 在TO-1/PD-L1抗体药物研发领域，目前进展最为靠前的当属美国Bristol-Myers Squibb/Medarex公司的抗-PDl抗体Nivolumab(代号BMS-936558,曾用代号MDX-1106) 及美国Merck公司的抗-PDl抗体Iambrolizumab(代号MK-3475),目前这两种抗体药物在 美国都已进入临床II/III期研究阶段。进展其次的是Roche/Genentech公司的抗F1D-Ll 抗体(代号MPDL3280A)，该药物目前在美国已进入临床I/II期研究阶段。这些抗体药物 主要用于治疗肺癌、黑色素瘤、肾癌等多种晚期肿瘤，其中早期临床试验（I期）结果表明抗 ro-i或抗H)-L1抗体药物不但具有抑制肿瘤增长及延长患者生存期的客观疗效，而且其长 期使用后安全性也在可接受范围（BrahmerJR等，JCO2010,28:3167-3175JopalianS 等，NEJM2012,366 :2443-2454;BrahmerJR等，NEJM2012,366 :2455-2465;HamidO等，NEJM2013, 369:134-144)。如Topalian等在2012年6月报道：在一项有296例晚期癌症患 者参与的I期临床研究中，每2周给予患者静脉注射美国BMS公司的名为Nivolumab(代号 为BMS-93655)的抗H)-l抗体后，结果有高达28%的黑色素瘤患者、27%的肾细胞癌患者及 出乎意料之高的18%非小细胞肺癌（NSCLC)患者，其肿瘤出现抑制或缩小；此外，该抗体药 物在临床疗效上还表现出长期可持续的特点：如在已随访1年以上的31位患者中，有20位 (64. 5%)临床上表现依然有效（TopalianS等，NEJM2012, 366 :2443-2454)。
[0017]类似的，Hamid等于2013年7月报道：在另一项有135例晚期黑色素瘤患者参与 的I期临床研究中，每2至3周给予患者静脉注射Merck公司的名为Lambrolizumab(代号 为MK-3475)的抗ro-1抗体后，结果有高达38%的患者肿瘤出现抑制或缩小；该抗体药物在 临床疗效上也表现出长期可持续的特点：如在随访中位数时间为11个月的52位肿瘤患者 中，有42位（81%)临床上依然有效，并还在继续接受该药物治疗（Hamid0等，NEJM2013， 369:134-144)。
[0018]鉴于ro-i与其受体ro-Li或ro-L2之间的结合具有位点多样复杂、涉及的氨基酸 数目多达几十个以上等特点，因此理论上推测应可以制备针对不同结合位点或氨基酸序列 的各种新的抗ro-i单克隆抗体。这些结合不同位点的单克隆抗体应具有新的用途与价值： 如该类抗体一方面可与目前上述的已处于临床研究阶段的抗ro-i或抗ro-Li抗体药物合 并使用，达到增强免疫功能及更好的抗肿瘤疗效；另一方面，该类抗体也有望开发成为独立 使用的新型免疫功能增强剂或抗肿瘤药物。
[0019] 因此，研发更多及更新的抗ro-i单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系就显得很 有意义与必要。
【发明内容】
[0020] 本发明要解决的技术问题之一提供一种拮抗抑制程序性死亡受体ro-i (programmeddeath-1)与其配体（PD-L1及F1D-I^)结合的鼠源单克隆抗体或其衍生体。该 鼠源单克隆抗体的衍生体包括人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、抗体Fab片段、单链抗体等。
[0021] 本发明要解决的技术问题之二是提供编码上述抗体的DNA分子或基因。
[0022] 本发明要解决的技术问题之三是提供制备上述抗体的方法。
[0023] 本发明要解决的技术问题之四是提供该抗体的用途，包括将上述抗体作为检测试 齐U，用于定量及定性分析生物样品中ro-i蛋白。
[0024] 为了获得更多及更新的抗ro-i单克隆抗体，在本发明中选取哺乳动物表达的重 组人ro-1胞膜外蛋白为免疫抗原，采用传统小鼠杂交瘤技术与重组基因工程方法获得了 多个新的抗ro-1的单克隆抗体。其中一代号为AB7的杂交瘤，其分泌的单克隆抗体不但可 与人ro-1蛋白特异结合，而且可以拮抗抑制ro-i与其受体（PD-L1及ro-L2)的结合。本发 明一方面提供了该杂交瘤株及其分泌的抗体；本发明另一发面公开了该抗体的重链可变区 与轻链可变区氨基酸序列及其编码DNA核苷酸序列；本发明还提供了该抗体的人-鼠嵌合 抗体及其衍生体；本发明还提供了表达与制备该人-鼠嵌合抗体及其衍生体的表达载体、 工程细胞及其方法。
[0025] 为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种拮抗抑制F1D-I(programmed death-1)与其配体结合的鼠源单克隆抗体，该抗体的特征是其轻链可变区具有SEQID NO. :1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQIDNO. :2所示的氨基酸序列。该鼠源单克 隆抗体来源于代号为AB7的小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2013年10月17日保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号为CGMCCNo. 8351.保藏地 点：中国，北京)。此外，本发明还提供编码上述鼠源单克隆抗体的DNA分子，其轻链可变区 具有SEQIDNO. :3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQIDNO. :4的核苷酸序列。
[0026] 本发明另一方面提供了来源于上述鼠源单克隆抗体的衍生体如人-鼠嵌合抗体、 人源化抗体、抗体Fab片段、单链抗体等。与鼠源单克隆抗体相比，人-鼠嵌合抗体或人源 化抗体作为治疗药物具有在人体中半衰期长(可长达20天）及免疫原性低等优点，便于长 期或反复多次体内使用。本发明中将上述鼠源单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因 分别与人抗体重链恒定区和轻链恒定区基因相连，获得人-鼠嵌合抗体cAB7。该人-鼠嵌 合抗体或其衍生体的特征是其轻链抗原互补决定区具有SEQIDNO:5,SEQIDNO:6及SEQ IDNO:7的氨基酸序列；其重链抗原互补决定区具有SEQIDNO:8,SEQIDNO:9及SEQID NO:10的氨基酸序列。此外，本发明还提供编码上述人-鼠嵌合抗体或其衍生体的DNA分子 或基因，其轻链可变区具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，重链可变区具有SEQIDNO:4 的核苷酸序列。
[0027] 本发明第三方面是提供了一种表达载体，它含有编码上述人-鼠嵌合抗体或其衍 生体的DNA分子序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
[0028] 本发明第四方面提供了一种重组宿主细胞，