A，用 M-MLV Reverse Transcriptase(Promega公司，美国）逆转录成cDNA，用焚光实时定量PCR 试剂盒 QuantiFast SYBR Green PCR(Qiagen 公司）检测 AFP、DNA 聚合酶 α、δ、ε 以及 内参蛋白β-Actin的mRNA水平。每一样品设置三复孔，实验至少重复三次。检测结果见 图 3A、3B、3C、3D。
[0104] 由图3A、3B、3C、3D可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相比，腺病毒表达载 体Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对三种DAN聚合酶的mRNA水平的抑制效果与细胞中AFP水平正 相关。在AFP强阳性的肝癌细胞H印G2中，Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对DNA聚合酶α、δ和 ￡基因的抑制率分别达到51.19%(口〈0.001，11 = 3)、58.27%(口〈0.001，11 = 3)和51.50% (ρ〈0. 001，η = 3);在AFP弱阳性的肝癌细胞H印3Β中，对DNA聚合酶α、δ和ε基因的抑 制率分别为25.51%&〈0.05，11 = 3)，34.33%&〈0.01，11 = 3)和 26.28%&〈0.01，11 = 3);而在AFP阴性的正常肝细胞HL7702中，对DNA聚合酶α、δ和ε基因的抑制率仅为 12.71% (ρ〈0·05，η = 3)，14·87% (ρ〈0·01，η = 3)和 12.06% (ρ>0·05，η = 3)。
[0105] 实施例6腺病毒表达载体对肝细胞肝癌细胞中DNA聚合酶α、δ、ε基因表达的 蛋白质水平的抑制效果（Western blot法）
[0106] 取对数生长期的人肝癌细胞H印G2、！fep3B和正常肝细胞HL7702，分别按 I. 2 X 106、I. 6 X IO6和5 X 10 5的量接种于6孔板中，用实施例2中构建的六种腺病毒表达载 体以MOI (感染复数）50分别感染48小时。
[0107] 收集感染细胞并裂解，用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo-Pierce公司，美国）测定 细胞总蛋白浓度；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）（8%分离胶，5%浓 缩胶）分离蛋白，电转移至PVDF膜（Merck Millipore公司，美国），封闭后，分别与1 : 100稀释的抗DNA聚合酶α、δ、ε的三种抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美 国）、抗 Caspase 3 抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）和 1 : 5000 稀释的抗 β -Actin抗体（Santa Cruz Biotechnology公司）于4°C结合过夜；用TBST缓冲液洗膜 3次，再与1 : 5000稀释的HRP(辣根过氧化物酶）标记的二抗（杭州联科生物技术有限 公司）结合，室温孵育2小时；用TBST洗膜3次，然后用化学发光试剂盒Clarify Wester ubstrate (Bio-Rad Laboratories公司，美国）显影，在化学发光凝胶成像仪上拍照、软件 分析Western blot条带。实验至少重复一次，检测结果见图4A、4B、4C。
[0108] 由图4A、4B、4C可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相比，腺病毒表达载体 Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对三种DAN聚合酶的蛋白水平的抑制效应与细胞中AFP水平正相 关，与对mRNA水平的抑制趋势相一致。
[0109] 在AFP强阳性的肝癌细胞!fepG2中，Ad/AFP-Casp-AFP-amiR对DNA聚合酶α、δ 和￡的抑制率分别达到42.91%(口〈0.05，11 = 3)，75.91%(口〈0.05，11 = 3)和61.03% (ρ〈0. 05, η = 3);在AFP弱阳性的肝癌细胞H印3Β中，对DNA聚合酶α、δ和ε的抑制率 分别为 54. 32 % (ρ〈0· 05, η = 3)，20. 58 % (ρ〈0· 05, η = 3)和 53. 96 % (ρ>0· 05, η = 2); 而在AFP阴性的正常肝细胞HL7702中，对DNA聚合酶α、δ和ε的抑制率仅为22. 88% (ρ>0· 05, η = 3)，14. 53% (ρ>0· 05, η = 3)和 6. 68% (ρ>0· 05, η = 3)。
[0110] 实施例7腺病毒表达载体对对肝细胞性肝癌细胞增殖的抑制效果（ΜΤΤ法）
[0111] 取对数生长期的肝癌细胞H印G2、!fep3B和正常肝细胞HL7702,按1父104细胞/ 孔于0. 5ml培养液的密度接种于24孔板中，用实施例2中构建的六种腺病毒表达载体以 MOI (感染复数）50分别感染。病毒感染72小时后，每孔加入MTT (噻唑蓝，Sigma公司，美 国）溶液，使终浓度为〇. 5mg/ml，于5% 0)2培养箱中37°C继续培养4小时。弃去培养上清 液，每孔加入异丙醇250ul以溶解紫色结晶物，取IOOul至96孔板，在微孔板检测仪上测定 样品在570nm波长的OD值，以690nm为参考波长，计算细胞存活率：
[0112] 细胞存活率=(病毒感染细胞的OD值/无病毒感染细胞的OD值）X 100% ;
[0113] 每个样品设立3复孔，实验至少重复二次。
[0114] 由图5可见，与空白对照腺病毒表达载体Ad/AFP相比，腺病毒表达载体Ad/ AFP-Casp-AFP-amiR对肝癌细胞增殖的抑制效应与细胞内AFP水平正相关。对AFP强阳性 的肝癌细胞H印G2存活率的抑制达56. 40% (p〈0. 001，η = 5)，对AFP阴性的正常肝细胞 HL7702的存活率的抑制仅为8· 72% (ρ〈0· 01，η = 5)。
【主权项】
1. 一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件，其特征在于，由第一表达框和第二表 达框组成，所述第一表达框由肿瘤特异性启动子、分别靶向DNA聚合酶a、6、e的三种 mircoRNA序列以及转录终止信号序列依次连接而成；所述第二表达框由肿瘤特异性启动 子、凋亡因子基因以及转录终止信号序列依次连接而成。
2. 如权利要求1所述的基因表达元件，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子为甲胎蛋 白启动子、癌胚抗原启动子或前列腺特异性抗原启动子。
3. 如权利要求2所述的基因表达元件，其特征在于，所述肿瘤特异性启动子为甲胎蛋 白启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 如权利要求1所述的基因表达元件，其特征在于，革El向DNA聚合酶a的mircoRNA 序列如SEQ ID No. 2所示，靶向DNA聚合酶S的mircoRNA序列如SEQ ID No. 3所示，靶向 DNA聚合酶e的mircoRNA序列如SEQ ID No. 4所示。
5. 如权利要求1所述的基因表达元件，其特征在于，所述凋亡因子基因为CaspaSe3、 Caspase6、Caspase7 或 Granzyme B 基因。
6. 如权利要求5所述的基因表达元件，其特征在于，所述凋亡因子基因为CaspaSe3基 因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
7. 如权利要求1所述的基因表达元件，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示， 该序列中，第一表达框由甲胎蛋白启动子、CaspaSe3基因以及串联连接的两个牛生长激素 基因多聚腺苷酸信号区BGH polyA依次连接而成；第二表达框由甲胎蛋白启动子、串联连 接的分别革El向DNA聚合酶a、5、e的三种microRNA序列以及BGH polyA依次连接而成。
8. 携带有如权利要求1?7任一所述基因表达元件的表达载体。
9. 如权利要求1?7任一所述基因表达元件在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制肿瘤细胞生长的基因表达元件及其应用。所述基因表达元件由第一表达框和第二表达框组成，第一表达框由肿瘤特异性启动子，分别靶向DNA聚合酶α、δ、ε的三种mircoRNA序列以及转录终止信号序列依次连接而成；第二表达框由肿瘤特异性启动子、凋亡因子基因以及转录终止信号序列依次连接而成。一方面，本发明以染色体复制必需的三个DNA聚合酶基因为靶点，对它们的表达同时进行有效抑制，使得肿瘤细胞因缺乏这三种DNA聚合酶而无法进行染色体复制，进而无法增殖；另一方面，利用凋亡因子促进停止增殖的肿瘤细胞凋亡，最终达到较为彻底的基因治疗的目的。
【IPC分类】C12N15-861, A61K48-00, A61K31-7088, A61K38-48, A61P35-00, C12N15-113, C12N15-57
【公开号】CN104611334
【申请号】CN201510024732
【发明人】贾振宇, 曹江, 刘昊, 魏群
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月19日