[0155] S.aureus(lX106CFU/mL)用 25iiM 药物在 25°C 下分别处理 0、30、60、90、150、和 240分钟，处理后，培养液1 :50稀释，置于冰上。取20 y L稀释液置于TH琼脂培养基上， 37°C培养24小时，记录菌落数。所有实验平行独立重复3到4次。
[0156] 5.均一脂质体（SVUs)的制备
[0157] 根据文献报道的方法进行脂质提取：S. aureus 50mL菌液摇床过夜培养。菌液 6000rpm离心15min，弃去上清液，得到菌体。菌体加入双蒸水重悬，6000rpm离心5min,重 复洗两次。清洗后，倒去水，依次加入总体积40mL有机溶剂（氯仿：甲醇：水=1 :2 :0. 8)。 每加入一种溶剂，涡旋振荡15s以充分分散，全部溶剂加入完毕，间隔摇18h。提取后，混浊 液加入有机溶剂（氯仿：甲醇：水=1 :1 :〇. 9)萃取，得到氯仿层。氯仿层蒸发旋转仪蒸干， 再用真空干燥仪除去剩余的溶剂，如此，可以得到〇. 127g脂质。
[0158] 脂质用KPB溶剂（0. 1M磷酸钾缓冲溶液0.1 mM EDTA pH7. 2)涡旋振荡溶解，得到 10mg/mL脂质溶液。脂质溶液反复用超声仪超声得到SVUs。
[0159] 6?色氨酸荧光实验
[0160] 使用RF-5301仪器（Shimadzu Japan)进行荧光测试。激发光、发射光通过的狭缝 分别为3nm、5nm。实验中，多肽的浓度为5iiM。多肽在SUVs溶剂体系为实验组，仅在KPB 溶剂体系为对照组，两组分别在280nm激发，发射波长扫描范围是290nm到500nm。
[0161] 7. PI吸收实验
[0162] PI荧光试剂检测多肽与细胞膜的作用。分别取lOuL 250iiM HA-FP-l、10iiL 1% triton X-100 (阳性对照）加入到80iiL S.aureus(lX107CFU/mL)菌液中。实验组在室温 下作用15min，阳性对照组作用5min。作用后，离心，弃去上清液，用PBS清洗两次。取2yL 液体制临时装片，用突光显微镜（Nikon Japan)观察。
[0163] 8.MTT 实验
[0164] IX 104/孔MDCK细胞于96孔板培养过夜后，加入多肽与MDCK细胞在37°C共同孵 化48h，弃去上清液，每孔加入100iiL 0. 5X10-3mg/mL MTT，再在37°C中孵育4h。最后，弃 去MTT溶液，加入150 y L DMS0溶解甲瓒晶体，用酶标仪在570nm测其吸收度。细胞存活率 的百分比计算：AT/ACX 100 (AT :实验组的吸光度AC :对照组的吸光度）。
[0165] 9.病毒滴度降低实验
[0166] 多肽抗活毒活性用病毒滴度降低实验测试。药物与病毒A/PR8/34(H1N1)、A/ Aichi/2/68(H3N2)在100TCID50中37°C孵育30min，随后，药物与病毒混合液加入到MDCK 细胞中，孵育60min。孵育后,细胞用PBS洗两遍以除去没有吸附的病毒，最后再加入维持液 孵育48h。处理48h后，移去维持液，加入lOOiiL 0. 5mg/mL的MTT孵育4h。孵育后，移去 MTT溶液，每孔加入150 ii L DMS0,在570nm处，酶标仪测试吸光度。
[0167]抑制率的计算：
【主权项】
1. 一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，其特征在于：该类融合肽衍生物 源于对流感病毒中融合肽的修饰改造，具体包括以下修饰改造后的氨基酸序列： GLFGAIAGFI _ NGff _ GMI _ G ； GLFGAIAGFI _ _Gff _ GMV _ G ； GLFGAIAGFI _ GGW Q GMV _ G ； GLFGAIAGFI _ G GWP GLV _ G ； GLFGAIAGFI _ _ GWP GLV _ G ； GLFGAIAGFI _ NGff _ GMI _ GWY ； GLFGAIAGFI _ _Gff _ GMV _ GWY ； GLFGAIAGFI _ GGW Q GMV _ GWY ； GLFGAIAGFI _ G GWP GLV _ GWY ； GLFGAIAGFI _ _ GWP GLV _ GWY ； GLFGAIAGFI _ NGff _ GMI _ GWYG ； GLFGAIAGFI _ _Gff _ GMV _ GWYG ； GLFGAIAGFI _ GGW Q GMV _ GWYG ； GLFGAIAGFI _ G GWP GLV _ GWYG ； GLFGAIAGFI _ _ GWP GLV _ GWYG ； I_NGW_GMI_GWYG ； I_NGW_GMI_GWY ； I _ _Gff _ GMV _ GWYG ； I _ GGW Q GMV _ GWYG ； I _ _Gff _ GMV _ GWY ； I _ GGW Q GMV _ GWY ； I _ G GWP GLV _ GWYG ； I _ _ GWP GLV _ GWYG ； I _ G GWP GLV _ GWY ； I _ _ GWP GLV _ GWY ； GLFGAIAGFI _ NG ； GLFGAIAGFI _ _G ； GLFGAIAGFI _ GG ； I_NOfi_ (Ml_GWYG ； I_NGH_GMI_(Wi； \ _ m _ m _ mYG； l _ Gm Q (MY _ mYG；i__m_om； i_cmQ6MV _m\； I _GmP6LY_OfiYG；l_ _mpGLY_mYG； I _Gm?6LV _ 6WY ； I_ _ 6WPGLV_ 6WY； 上述序列中横线位置独立为带正电荷的氨基酸、或其类似物、或其异构体、或其盐、或 其衍生物、或其络合物、或其水合物中的一种，所述异构体包括几何异构体和光学异构体； 上述斜体表示的甘氨酸胡S可以独立替换成丙氨酸、D-丙氨酸、0 -丙氨酸、N-甲基 丙氨酸、亮氨酸、D-亮氨酸、高亮氨酸、D-高亮氨酸、N-甲基亮氨酸、正亮氨酸、D-正亮氨酸 (D-Nle )、N-甲基正亮氨酸中的一种，或者为前述氨其酸的异构体、盐、衍生物、络合物、水合 物中的一种，所述异构体包括几何异构体和光学异构体。
2. 根据权利要求1所述的融合肽衍生物，其特征在于：所述的带正电荷的a -氨基 酸包括赖氨酸、D-赖氨酸、单甲基赖氨酸、双甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、精氨酸、D-精氨 酸、高精氨酸、单甲基精氨酸、对称双甲基精氨酸、不对成双甲基精氨酸、鸟氨酸、D-鸟氨酸、 2, 4-二氨基丁酸、2, 3-二氨基丙酸。
3. -类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，其特征在于：该类融合肽衍生物 为对权利要求1或2任一所述的融合肽衍生物进行脂化、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、 酯化、N-酰化、通过二硫键环化、转化成酸加成盐、二聚体化、多聚体化或/和缀合化修饰后 所得到的新的融合肽衍生物。
4.根据权利要求3所述的融合肽衍生物，其特征在于：所述脂化中所用到的脂质基团 选自脂肪酸，磷脂基团，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱， 心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯，胆固醇，五环三萜类基团中至少一种。
5.根据权利要求4所述的融合肽衍生物，其特征在于：所述脂化中所用到的脂质基团 为脂肪酸，所述脂肪酸为C6~C20脂肪酸。
6.根据权利要求4所述的融合肽衍生物，其特征在于：所述C6~C20脂肪酸为月桂 酸、棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或花 生酸。
7. -类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，其特征在于：该类融合肽衍生物 的序列分别为： HA-FP-1：GLFGAIAGFIKNGWKGMIKG(SEQIDN0:1)； HA-FP-2：GLFGAIAGFIKGGWQGMVKG(SEQIDN0:2)； HA-FP-2-1：GLFGAIAGFIKKGWKGMVKG(SEQIDN0:3)； HA-FP-3：GLFGAIAGFIKGGWPGLVKG(SEQIDN0:4)； HA-FP-3-1：GLFGAIAGFIKGGWPGLVKG(SEQIDN0:5)； HA-FP-1-22：GLFGAIAGFIKNGWKGMIKGWY(SEQIDN0:6)； HA-FP-1-13:IKNGWKGMIKGWY(SEQIDN0:7)； HA-FP-1-13-1:IKNAWKAMIKAWY(SEQIDN0:8)； HA-FP-1-13-2:IKNLWKLMIKLWY(SEQIDN0:9)〇
【专利摘要】本发明公开了一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，这些融合肽衍生物为流感病毒融合肽中部分带负电荷、不带电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸及其类似物替代后所得到的。这些融合肽衍生物为兼具抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、抗病毒作用的新型融合肽；其具有抗流感病毒活性，能够通过抑制流感病毒HA2亚基在酸性条件下的构象变化，达到阻断流感病毒进入宿主细胞内。这些多功能抗微生物多肽在病毒性感冒合并细菌感染存在潜在的应用的前景。
【IPC分类】C07K19-00, A61P31-04, A61P31-16
【公开号】CN104628869
【申请号】CN201510045228
【发明人】何坚, 刘叔文, 王静瑜, 林冬果, 武文姣
【申请人】南方医科大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月28日