0ml/个； (6) 步骤（3) -（5)于超净台内操作。冷却后成琼脂状，标记培养基名称及配制日期， 放于4°C冰箱待用。
[001引 2.肉汤固体培养基（MRS)配制： (1) 将琼脂粉配成溶液，1. 59/lOOml去离子水； (2) 加入 MRS Broth 17. 91 g/lOOml 琼脂溶液，混匀； (3) 放入高压锅，1. 0 MPa蒸20分钟； (4) 同上述步骤（5)、（6)。
[0020] 3.肉汤液体培养基（MRS)配制： (1) 将MRS Broth加入去离子水，比例为17. 91 g/lOOml ; (2) 放入高压锅，1. OMPa蒸20分钟； (3) 待高压锅无压力后取出，分装至EP管中，每个1.0 ml。标记培养基名称及配制日 期，放于4C冰箱待用。
[0021] 4.过氧化氨化〇2)鉴定培养基配制： (1) 同肉汤固体培养基（MRS)配制步骤（1)至（4); (2) 待高压锅无压力后取出，稍冷却，但仍为液体状态时于超净台内加入TMB (终浓度 0. 25 mg/ml)、HRP (终浓度 0. 01 mg/ml),混匀； (3) 待培养基温度降至室温后倒入培养皿，冷却后成琼脂状，标记培养基名称及配制日 期，放于4C冰箱待用。
[0022] 实施例1、卷曲乳杆菌1x262-1菌群的分离和接种、纯化、增菌培养 一、卷曲乳杆菌LC262-1菌群的分离和接种；样品收集采用美国抓公司的化的.A-Cd 系统。用两个无菌棉拭子采集受试者阴道侧壁上1/3的分泌物，24小时内W不同浓度接种 于装有配制好的Rogosa化培养基的培养皿，并标记信息，将培养皿置于厌氧罐中，并放入 0)2产气袋，置于37C赔育箱，赔育4她W上。
[0023] 二、卷曲乳杆菌菌株1x262-1的纯化、增菌培养；按照菌落不同形态(表面、边缘 等)、大小分别计数，形态相同、大小一致的记为一种，接种环挑取单个菌落中少许细菌，按 "斜线法"接种至MRS固体培养基W得到分离纯化的单菌落；菌牙签挑取MRS固体培养基上 的单菌落少许细菌，接种至MRS液体培养基，置于37C赔育箱，厌氧培养2化-72h。筛选出 新的菌株，命名为卷曲乳杆菌1x262-1。
[0024] 实施例2、卷曲乳杆菌1x262-1菌株的菌种鉴定 一、培养特性、染色镜检及形态学特征：培养后得到的菌落如图1，菌落呈灰白色圆形， 中间饱满，周围弥散，不规则；取该菌纯培养物涂片进行革兰氏染色，结果如图2,呈现革兰 氏阳性，短杆装，可连成长链；电镜分析结果见图3,电镜下该菌株无芽抱，无鞭毛，无芙膜， 菌株大小为26. 824X6. 667um。结果表明；所分离菌株初步判定为乳杆菌属。
[002引二、leSrDNA基因序列鉴定；W细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并采用 引物对8F/926R进行PCR扩增，取PCR产物进行凝胶电泳，确定leSrDNA基因片段，满意结 果为于950bp处得到单一清晰的PCR产物条带，见图4,将满意的PCR产物进行纯化及DNA 序列测定，采用Sanger测序法，测序引物为8F/926R，测序仪器ABI3730,通过GenBank数据 库中的BLAST程序进行序列相似性比较分析，根据最高同源性分值(大于98%)即可确定乳 杆菌的种属。leSrDNA的部分序列见序列表SEQ ID N0;1，8F序列见序列表SEQ ID N0;4， 926R序列见序列表SEQ ID N0;5,其中R代表G或A。
[0026] H、生理生化特征；通过走叶巧水解试验、甲基红试验（MR试验)、己醜甲基甲醇试 验（VP试验)、說基质试验、H糖铁试验、克氏双糖铁试验、尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试 验、氨基酸脱駿酶试验、明胶液化试验、丙二酸轴试验、巧樣酸盐实验(构稼酸盐实验)、硝酸 盐还原试验、石蕊牛奶试验、细菌动力试验测定菌株生理生化反应，得如下结果：卷曲乳杆 菌菌株1x262-1能够水解走叶巧生成葡萄糖和走叶素、MR试验呈阳性说明代谢葡萄糖产 生有机酸、VP试验呈阴性说明代谢葡萄糖不产生丙丽酸、說基质试验试验结果为该菌不分 解蛋白腺中色氨酸而产生剛巧、H糖铁试验说明代谢乳糖葡萄糖不产生HsS、克氏双糖铁试 验说明代谢乳糖不产生^S，尿素酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、氨基酸脱駿酶试验、明胶液 化试验均呈阴性，说明该菌不产生尿素酶、苯丙氨酸脱氨酶、氨基酸脱駿酶、明胶酶，丙二酸 轴试验、巧樣酸盐实验(构稼酸盐实验)、硝酸盐还原试验均呈阴性，说明该菌不利用丙二酸 轴作为碳源、不利用构稼酸盐作为氮源和碳源、不还原硝酸盐成亚硝酸盐，石蕊牛奶试验发 现该菌可使牛奶发酵但不凝固，说明该菌生在胚盛、不产凝乳酶，细菌动力试验呈阴性。采 用法国梅里埃公司生产的API 50 CHL乳杆菌鉴定系统对菌株进行生化鉴定，鉴定结果为 2化、4她时，可使半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-己醜-葡糖胺、苦杏仁巧、熊果巧、走叶 灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、藏糖、淀粉发酵，反应中呈阳性；甘油、赤薛醇、D-阿拉伯 糖、k阿拉伯糖、核糖、D-木糖、k木糖、阿东醇、目-甲基-D-木糖巧、山梨糖、鼠李糖、卫 茅糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、a -甲基-D-甘露糖巧、a -甲基-D-葡萄糖巧、蜜二糖、菊糖、 松皇糖、木糖醇、塊牛儿糖、D-松二糖、D-来苏糖、D-培格糖、D-岩糖a-岩糖、D-阿拉伯糖 醇、k阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-丽基-葡萄糖酸盐、5-丽基-葡萄糖酸盐不发酵，反应 中呈阴性；海藻糖、棉子糖、糖原呈弱阳性，其中底物空白时反应均为阴性，由此生化图谱判 定菌株生化特性符合卷曲乳杆菌的生化特性。
[0027] 实施例3、卷曲乳杆菌1x262-1菌种代谢产物测定 一、 菌种代谢产物中乳酸含量测定:D-乳酸检测试剂盒测定本菌株D-乳酸的产量，结果 测得为6. 213g/L ;传感分析仪测得k乳酸的含量为3. 789g/L，结果见下表1中TO组数据。
[0028] 表1乳酸测定结果
【主权项】
1. 一种卷曲乳杆菌，其特征在于所述卷曲乳杆菌命名为卷曲乳杆菌 Cri1SAaiw1S) Lc262-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No. 6469〇
2. -种利用权利要求1所述的卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCC No. 6469制成的菌剂，其特 征在于所述菌剂活性成分为卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCCNo. 6469。
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂形态为液态或固态或凝胶态。
4. 如权利要求1所述的卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCC No. 6469在妇科医疗器械中的应 用。
5. 根据权利要求4所述的卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCC No. 6469在妇科医疗器械中的 应用，其特征在于所述医疗器械包括阴道镜、妇科自检镜、阴道扩张器、窥阴器、妇科盆腔炎 症治疗仪、妇科冲洗器或妇女外用抗菌器。
6. 如权利要求1所述的卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCC No. 6469在妇科消毒产品中的应 用。
7. 根据权利要求6所述的卷曲乳杆菌Lc262-1 CGMCC No. 6469在妇科消毒产品中的 应用，其特征在于所述消毒产品包括粘膜消毒液、粘膜消毒液膏、妇科消毒护垫、妇科消毒 纸巾、妇女外用抗菌凝胶、妇女外用抗菌膏或妇科消毒剂。
8. 如权利要求1所述的卷曲乳杆菌1x262-1 CGMCC No. 6469在女性阴部用化妆品中 的应用。
9. 根据权利要求8所述的一种卷曲乳杆菌1x262-1 CGMCC No. 6469在女性阴部用化 妆品中的应用，其特征在于所述化妆品包括女性阴部护理液、女性阴部护理霜、女性阴部护 理膏、女性阴部护理膜或沐浴露。
【专利摘要】本发明公开了一种卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus）Lc262-1和包含该菌株的菌剂及其在妇女保健产品中的应用，所述卷曲乳杆菌Lc262-1是卷曲乳杆菌属的新菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.6469，该卷曲乳杆菌Lc262-1是阴道的优势菌，能稳定分泌乳酸、过氧化氢等物质，保持阴道的酸性环境，抑制有害细菌的生长，安全无毒、可稳定传代以及扩大培养并可长期保存，所述卷曲乳杆菌Lc262-1和包含该菌株的菌剂应用于妇女保健产品例如是医疗器械、消毒产品或者化妆品。CGMCC No 646920130822
【IPC分类】C12R1-225, A61K35-747, A61L31-16, A61Q19-10, C12N1-20, A61P31-02, A61K8-99, A61Q19-00, A61L15-36, A61L15-44
【公开号】CN104630083
【申请号】CN201310551630
【发明人】李建龙
【申请人】苏州欧赛微科生物医药科技有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月8日