免疫之前眼眶取阴性血清。免疫方法如下:取60 μ g免疫原，用生理盐水稀释到200 μ 1，再加入等体积弗氏佐剂，用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水。将混匀好的免疫原进行皮下注射免疫，打6-8个点。每隔两周进行一次加强免疫，免疫量为30 μ g蛋白/只小鼠。第四次加强免疫后，ELISA法检测效价，选择效价较高的两只小鼠，免疫剂量为50μ g蛋白/只小鼠，腹腔冲击免疫一次。
[0028]最后一次免疫后一周,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞,采用PEG法进行融合；融合后的细胞用含15%血清的IMDM培养基培养细胞。
[0029]用自制包被原“PBA-0VA”包板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-0VA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，共选择6株IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株进行竞争ELISA法复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株PYR#6-E4进行后续操作和保藏。
[0030]实验2单克隆抗体纯化与鉴定
[0031 ] 将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株PYR#6_E4接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用protein G亲和层析柱进行纯化,得到抗多环芳烃单克隆抗体，间接ELISA法检测纯化后抗体效价可达I X 105，采用竞争ELISA法对抗体进行鉴定，具体鉴定方法如下:
[0032]间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法:将包被原PBA-OVA用包被液稀释至2.5 μ g/ml，每孔加100 μ I包被酶标板，4°C，过夜；PBS-T洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200 μ I/孔；将竞争物稀释液50 μ I/孔和单克隆抗体稀释溶液50ul/孔混匀后加入酶标板孔中，同时设置零标准对照孔(稀释液中不加竞争物)和空白对照孔(将抗体溶液换为稀释液)，37°C孵育Ih ；PBS-T洗涤2次后，加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100 μ I/孔，37°C孵育Ih ；PBS-T洗涤2次，加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入2mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。以吸光度为纵坐标，以标准浓度的LOG值为横坐标，绘制半对数标准曲线。
[0033]图1为杂交瘤细胞株PYR#6_E4产生的抗多环芳烃单克隆抗体对芘间接竞争ELISA标准曲线，横坐标为竞争物芘浓度的对数值，纵坐标为吸光度值，此结果表明杂交瘤细胞株PYR#6-E4成功分泌了抗多环芳烃单克隆抗体。
【主权项】
1.一种分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株PYR#6-E4，其特征在于，保藏编号为 CGMCC N0.8552。
2.根据权利要求1所述的抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，其制备方法包括如下步骤: 1)动物免疫 2)取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合 3)阳性细胞株筛选 4)抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选与保藏。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，所描述的方法包括如下步骤: 1)动物免疫 以“PBA-BSA”作为免疫原，免疫用小鼠为18g左右的BALB/C，7-8周；免疫之前眼眶取阴性血清。取60 μ g免疫原，用生理盐水稀释到200 μ 1，再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此后，每隔两周，进行一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只小鼠。共进行四次加强免疫后，眼眶取血，测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫，免疫量为50 μ g蛋白/只小鼠。效价达到1:10000即可做细胞融合。 2)细胞融合 取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0,采用PEG法进行融合。融合的细胞用含15%血清的MDM培养基培养。 3)阳性细胞株筛选 以“PBA-OVA”作为检测抗原包被酶标板，对培养于96孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后，再用“PBA-OVA及BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，选择IgGl类型的阳性杂交瘤细胞株。最后，对已筛选的阳性克隆采用竞争ELISA法进行复筛，选择具有明显竞争反应的细胞株进行后续操作。 4)抗体纯化和鉴定，杂交瘤细胞株的筛选 将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株PYR#6-E4接种小鼠BALB/C腹腔，制备腹水，采用protein G亲和层析柱进行纯化,得到抗多环芳烃单克隆抗体，间接ELISA法检测纯化后抗体效价可达I X 105，采用竞争ELISA法对抗体进行鉴定，选择亲和力较高的抗体进行保藏。
4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤3)和4)中，所述竞争ELISA方法包括如下步骤: 以PBA-OVA包被酶标板，10ul/孔，4°C过夜；洗涤2次，用2%脱脂奶粉，37°C封闭2h，200ul/孔，加入竞争物(按照设计比例加入竞争物(芘)，50ul/孔；加入一抗(抗血清纯化抗体按照选定比例稀释后加入)，50ul/孔，37°C孵育lh。设置空白对照和不抑制对照，洗涤2次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗，100μ I/孔，37°C孵育lh，洗涤2次。加入TMB底物显色液显色15min，100 μ I/孔。再加入2mol硫酸终止显色，双波长(450，630)测定吸光值，记录保存数据。
5.权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗多环芳烃单克隆抗体。
6.权利要求5所述的单克隆抗体在多环芳烃类化合物检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述的单克隆抗体在制备多环芳烃检测 试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株PYR#6-E4及其产生的单克隆抗体。本发明所述抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCC No.8552，该杂交瘤细胞株能够稳定分泌产生抗多环芳烃单克隆抗体，该抗体效价较高，可用于多环芳烃ELISA检测试剂盒的研制。CGMCC No855220131121
【IPC分类】C12N5-20, C12N15-06, C07K16-44, G01N33-577
【公开号】CN104711228
【申请号】CN201310670080
【发明人】许丽, 赵鲁, 程言君
【申请人】许丽, 赵鲁, 程言君, 轻工业环境保护研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月12日