epes缓冲液洗脱，紫外检测器280nm检测洗脱液，收集第一个洗脱峰并在4°C下6000rpm超滤离心浓缩到与起始上清液相同的体积5mL，用于实施例3。
[0028]实施例2:
[0029]上清液粗酶直接用作生物催化剂:
[0030]取上述实施例1中的上清液lmL，加入ImM化合物6 (助剂为DMSO)和3mM NADPH，三个重复，在28°C恒温水浴中反应4h，每个反应加入0.3 μ g内标化合物4-羟基二苯甲酮，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.lmL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图3所示，生成的氧杂环庚三烯-2 (3H)-酮类化合物7极少，与内标的峰面积之比，三个重复的平均值为0.014。
[0031]实施例3:
[0032]凝胶过滤处理后得到的粗酶用作生物催化剂:
[0033]取上述实施例1中的经凝胶过滤处理后得到的粗酶lmL，加入ImM化合物6 (助剂Sdmso)和3mM nadph，三个重复，对照为煮沸失活的粗酶，在28°c恒温水浴中反应4h，每个反应加入0.3 yg内标化合物4-羟基二苯甲酮，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.lmL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图4所示，生成的氧杂环庚三烯-2 (3H)-酮类化合物7极为显著，与内标的峰面积之比，三个重复的平均值为1.042，比实施例2中上清液粗酶的酶活性提高了 70倍以上。
[0034]实施例4:
[0035]不同缓冲液对芳环单加氧扩环酶催化6形成7的影响:
[0036]采用浓度均为25mM但pH值各不相同的三种缓冲液，分别是pH7.5Hepes (羟乙基吡啶乙磺酸)，pH6.4Mes (吗啡啉乙磺酸)和pH 5.3Mes。取上述三种缓冲液2mL分别与2g菌丝按照上述实施例1制备凝胶过滤的粗酶2mL，然后按照上述实施例3进行催化反应，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 203，结果如图5所示，在pH7.5Hepes缓冲液中生成的氧杂环庚三烯-2 (3H)-酮类化合物7极为显著，与内标的峰面积之比达到1.15，在pH6.4Mes缓冲液中生成的7与内标的峰面积之比为0.22，在pH5.3Mes缓冲液中没有检测到产物7。因此，优选pH7.5Hepes (25mM)缓冲液用于酶制备和酶催化。
[0037]实施例5:
[0038]对化合物8的转化:
[0039]取上述实施例1中的经凝胶过滤处理后得到的粗酶lmL，加入ImM化合物8 (助剂为DMSO)和3mM NADPH,对照为煮沸失活的粗酶，在28°C恒温水浴中反应4h，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩至0.lmL，经液相质谱检测准分子离子峰[M+Na]+m/z 231，生成的氧杂环庚三烯-2 (3H)-酮类化合物I极为显著。
[0040]上述实施例2、3、4和5的检测条件均为:仪器为美国Agilent Technologies公司1290/6530UPLC-Q-T0F液相色谱-质谱联用仪。质谱条件:电离方式为双源ESI ;能量3500V ;质量范围 50-500。液相色谱条件:ZORBAX Eclips Plus C18 Rapid Resolut1n HD柱(50mmX2.1mmX 1.8 μπι);柱流量为0.3mL/min ;进样量LOyL ;化合物I及标准品采用25%甲醇75%水进行层析洗脱；化合物I及标准品采用43%甲醇57%水进行层析洗脱；样品与标准品同时检测。
【主权项】
1.芳环单加氧扩环酶，其特征在于其由下述方法制备而得:将真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)的菌丝勾楽上清液经过凝胶过滤、离心浓缩步骤制备而得。
2.芳环单加氧扩环酶，其特征在于其由下述方法制备而得:由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入S^hadex G - 25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。
3.权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶的制备方法，其特征在于由发酵培养得到的褐盖韧革菌菌丝在缓冲液中匀浆，匀浆液经离心后得到上清液，将上清液加入S^hadexG - 25凝胶柱进行凝胶过滤，收集第一个洗脱峰并浓缩。
4.氧杂环庚三烯_2(3H)-酮类化合物的制备方法，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。
5.氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物的制备方法，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMS0，在28°C恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液PH值为7.5 Ofepes，25mM)。
6.权利要求1所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物。
7.权利要求1所述的芳环单加氧扩环酶在制备氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物中的应用，其特征在于应用权利要求1或2所述的芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，以酚类芳环化合物为底物，助溶剂为DMS0，在28°C恒温水浴中，经过单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2 (3H)-酮类化合物，酶制备和酶催化的缓冲液pH值为7.5 (Hepes, 25mM)。
【专利摘要】本发明涉及一种来自真菌的芳环单加氧扩环酶，其制备方法及用于酚类芳环的氧化以制备氧杂环庚三烯酮类化合物的应用。所述的芳环单加氧扩环酶是将真菌褐盖韧革菌(Boreostereum vibrans)的菌丝匀浆上清液经过凝胶过滤、离心浓缩等步骤制备而得；利用芳环单加氧扩环酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化酚类芳环进行单加氧扩环氧化生成氧杂环庚三烯-2(3H)-酮类化合物，为这类稀有化合物的合成提供一种条件温和、对环境友好、只需一步催化反应的新途径。
【IPC分类】C12N9-02, C12R1-645, C12P17-08, C12P17-18
【公开号】CN104711235
【申请号】CN201510033023
【发明人】曾英, 刘吉开, 杨彦龙
【申请人】中国科学院昆明植物研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年1月22日