CIV按1 :1混合，免疫剂量和免疫方式与首免 相同。三免结束后尾尖采血，分离血清，用间接ELISA方法测其抗体效价。细胞融合的前3d 对抗体效价最高的小鼠腹腔注射纯化好的H3N2CIV 0. 3mL进行第四次免疫，3d后取小鼠脾 脏进行细胞融合。
[0042] 表1小鼠免疫程序
[0043]
[0044] 5、间接ELISA最佳H3N2CIV包被浓度的确定
[0045] a.包被：将纯化的 H3N2CIV 按 I :100、1 :200、1 :400、1 :800、1 :1,600 的比例用包 被液稀释后包被96孔酶标板，100 μ L/孔。以包被液作空白对照，4°C过夜孵育后，弃包被 液，PBST 洗涤 5 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0046] b.封闭：用含0. 5 % PVA的封闭液，200 μ L/孔，37 °C封闭Ih后，弃封闭液，PBST洗 涤 3 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0047] c.加样：BALB/c 小鼠阳性血清作一抗，以 PBST 按 1 :200、1 :400、1 :800、1 :1，600、 1 :3,200、1 :6, 400的比例系列梯度稀释；小鼠阴性血清以相同比例稀释，作为阴性对照， 100 μ L/ 孔，37°C孵育 Ih 后，弃一抗，PBST 洗涤 5 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0048] d.孵育二抗：加 1 :10, 000 稀释的 Goat anti-Mouse IgG(H&L)-HRP 二抗，100 μ L/ 孔，37°C孵育，进行ELISA方阵试验。Ih后，弃二抗，PBST洗涤5次（200 μ L/孔，2min/次）。
[0049] e.显色：加入TMB底物显色液，100 μ L/孔，37°C避光显色15min。
[0050] f.加终止液：加入2M H2SO^止显色反应，100 μ L/孔。
[0051] g.测OD值：迅速用提前30min预热的酶标仪进行双波长检测，参考波长设定为 630nm，测定 0D45(lnm{t。
[0052] 间接ELISA试验结果的判断标准：（1)抗原最适包被浓度的确定：阴性对照的A值 在0.2左右，阳性孔的A值在1.0左右，且P/N值最大。P/N=(阳性值一空白值V (阴性 值一空白值）。
[0053] (2)待检样品阴阳性的确定：待检样本P/N多2. 1为阳性，反之为阴性。
[0054] (3)待检样品ELISA效价的确定：待检样品按不同方式梯度稀释后，测定各孔的OD 值，以P/N多2. 1时的最大稀释度仍出现阳性反应的最大稀释度作为待检样品ELISA效价。
[0055] 实验结果：根据方阵试验所得结果确定，H3N2CIV最适包被浓度为8. 25 μ g/ mL (200倍稀释）（表2)。以此浓度H3N2CIV包被酶标板，测定3免后7d小鼠血清抗体效价。 将采集的小鼠血清从1 :5, 000倍比稀释至1 :320, 000,测得效价均在1 :80, 000以上，抗体 水平达到融合需要（表3)。
[0056] 表2 H3N2CIV纯化后ELISA最适包被浓度测定结果
[0057]
[0058] 表3小鼠3免后血清抗体效价检测结果
[0059]
[0061] 6、杂交瘤制备
[0062] a.饲养细胞的制备：本实验以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，于细胞 融合前Id将其均匀铺在96孔细胞板中。饲养细胞的制备过程如下：
[0063] SI.取一只8周龄的雌性BABL/c小鼠，摘眼球采血收集至I. 5mL EP管内，分离到 的血清作杂交瘤细胞筛选时的阴性对照，-20°C备用。小鼠处死后于75%酒精中浸泡5min ;
[0064] S2.无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤，充分暴露，但不要破坏腹膜。吸取8mL HAT选 择性培养液注入腹腔。反复吸打十余次，完毕后将含有腹腔巨噬细胞的培养基转移至无菌 细胞培养皿中。先取少量在显微镜下计数细胞个数，然后在培养皿中补加 HAT培养液混匀， 调整细胞浓度为IO5个/mL ;将含饲养细胞的HAT培养液混匀后加至96孔细胞培养板中，每 孔100 μ L。之后，于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。24h后，观察细胞状态，细胞应无污 染，呈多形性，折光性好且贴壁紧密。
[0065] b.小鼠免疫脾细胞的制备
[0066] 本次实验中，为提高融合细胞数量和防止单只小鼠脾细胞数量不足，取1号和3号 (表3)小鼠脾细胞混在一起使用，小鼠脾细胞制备为常规方法。
[0067] c.细胞融合
[0068] SI.分别取出准备好的SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，悬浮混勾，按细胞个数1 : 10的比例吸取两种细胞于50ml离心管中。混勾后，1，OOOr/min离心10min，弃上清。用手 指轻轻拍打管底，将沉淀细胞弹成泥浆。在以下各步试验中应保持离心管置于含37°C灭菌 CldH2O的烧杯中。
[0069] S2.吸取37°C预热的Iml 50% PEG-1000细胞融合剂，在Imin内加至细胞泥浆， 静止lmin。接下来开始滴加 DMEM基础培养基以终止融合，在第一个Imin内加 lmL，第二个 Imin内加2mL，第三个Imin内加3mL，第四个Imin内加4mL，第五个Imin内加5mL。在进行 这步操作时要均匀缓慢滴加培养基和轻轻晃动离心管。最后用DMEM基础培养基缓慢补加 至40mL。轻轻混勾后，1，000r/min离心10min，弃上清。缓慢加入HAT选择性培养液并轻轻 摇匀；将融合后的细胞加到已铺好饲养细胞的96孔板中，每孔100 yL，于37°C、5% CO2细 胞培养箱中培养。使用HAT培养液每3d半量换液一次。待培养孔中出现细胞集落且长至 孔底面积约20%~30%时，及时采集这些孔的上清液，鉴定是否有特异性抗体产生。第IOd 以后，采用HT培养液半量换液。第17d以后采用完全DMEM培养基培养细胞。
[0070] S3.阳性杂交瘤细胞株的亚克隆
[0071 ] 在融合细胞集落长到孔底面积20 %~30 %时，采用间接ELISA方法对有融合细胞 生长的细胞培养上清液及时鉴定，以确定其中是否存在针对H3N2CIV的特异性抗体。方法 同上述步骤5。不同之处为，一抗采用融合细胞培养上清液。试验中同时取骨髓瘤细胞培养 上清液、免疫小鼠阳性血清及正常小鼠血清做对照，阳性孔需及时进行下一步的亚克隆和 扩大培养。
[0072] 在阳性孔细胞亚克隆化前一天，使用完全DMEM培养基在96孔板内制备好饲养层 细胞，IO 4个/100 μ L/孔。用完全DMEM培养基将待亚克隆的细胞从培养板轻轻冲下，计算 细胞数。采用有限稀释法将细胞逐步均匀稀释至10个/mL，加至含饲养细胞的96孔培养板 中，100 μ L/孔。每天观察细胞状态，第4d时，用完全培养基半量换液。待杂交瘤细胞长至 孔底面积20%~30%时，用间接ELISA法再次检测上清。从中选取仅单个细胞集落生长且 阳性值较高孔进行第二次亚克隆。之后如此重复，直至所有克隆细胞孔都为阳性。获得稳 定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，先用24孔细胞板，再用6孔细胞板及时逐步扩大培 养并冻存（_8〇°C冰箱中梯度过夜降温后，转移至液氮罐内，长期保存备用）。
[0073] 实验结果：将融合后的细胞分装于4块96孔细胞培养板中，经HAT培养液的选择 性培养，细胞于融合后前2d有大量死亡，从第5d开始出现杂交瘤细胞，如图2。待其长至孔 底面积约20%~30%时，取培养上清液进行ELISA检测，结果见表4至表8。
[0074] 表4细胞融合后第lid ELISA检测结果（第1板）
[0075]
[0076]
[0077] 表5细胞融合后第lid ELISA检测结果（第2板）
[0078]
[0079] -表6细胞融合后第η天的ELISA检测^果Z第3板)-' ' ' '
[0080]
[0081]-表7细胞融合后第11天的ELISA检测结果（第4板)
[0084] 表8各板对照组检测结果
[0085]
[0086] 注：小鼠阳性血清均提前稀释40, 000倍。
[0087] 根据表4至表8的数据并结合显微镜观察，对11株阳性孔杂交瘤细胞进行第一次 亚克隆。其中，仅2C5(第2板的C5孔）第一次亚克隆后有阳性孔，其它株未筛出阳性。对 2C5使用有限稀释法连续进行第二次和第三次亚克隆，阳性率均为100%。三次亚克隆的检 测结果见表9。
[0088] 表9 2C5的亚克隆检测结果
[0089]
[0090] 注：各次亚克隆中，小鼠阳性血清均提前稀释20, 000倍。其中，El为小鼠阳性血 清对照，E2为小鼠阴性血清对照，Fl为SP2/0细胞上清对照，F2为空白对照。
[0091] 将2C5进行保藏，该细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心， 杂交瘤细胞株命名为H3N2-CIV-HA-2C5,保藏编号为CCTCC C201555。
[0092] 实施例2单克隆抗体的制备
[0093] 雌性BALB/c小鼠腹腔内注射FICA，0. 5mL/只。7d后用灭菌生理盐水洗涤悬浮对 数期生长的杂交瘤细胞2C5 (取对数生长期细胞培养液上清，测定McAb效价），细胞密度调 至2 X IO6个/mL。每只小鼠腹腔注射0. 5mL细胞悬液，逐日观察小鼠腹部是否膨大，待其明 显鼓起时抽取腹水，置于EDTA处理过的