0· 125、0· 06125、0· 03125、 0. 015625 μ g/mL倍比稀释包被酶标板。HAU效价为28的H3N2CIV尿囊液（实施例1)作1 : 8、1 :16、1 :32、1 :64、1 :128、1 :256的倍比稀释。兔抗H3N2CIV多克隆抗体使用浓度为I yg/ mL，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)_HRP作1:10000稀释。以此程序进行方阵试验，确定最适 McAb包被浓度和病毒尿囊液参考稀释度。判定标准为阴性孔的A值在0. 2左右，阳性孔的 A值在I. 0左右，且P/N值最大。
[0147] 二、兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定
[0148] 以最适McAb包被浓度包被酶标板，最适H3N2CIV尿囊液稀释度加样。兔抗 H3N2CIV 多克隆抗体作 20、10、5、2·5、1·25、0· 625 μ g/mL 倍比稀释，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP作I :10000、1 :20000、1 :40000、1 :80000倍比稀释。以此程序进行方阵试验， 确定兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度。判断标准同实施例1。
[0149] 三、双抗体夹心ELISA最佳反应条件的确定
[0150] 在确定各种抗体抗原最适反应浓度后，依次对封闭液种类（0. 1 % BSA，1 % BSA， 5%脱脂乳，1%PVA，0. 5%PVA)，各步反应作用时间（0. 5、1、1. 5、2h)，底物显色时间（5、10、 15、20min)等条件逐一优化。判断标准同实施例1。
[0151] 经试验确定McAb最适包被浓度为0. 25 μ g/mL ;最适H3N2CIV尿囊液稀释度为 I :128 ;最适兔抗H3N2CIV多克隆抗体工作浓度为2. 5yg/mL ;最适Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP稀释度为I :10000 ;最佳封闭液为5%脱脂奶粉；最佳封闭时间、最佳尿囊 液孵育时间、最佳多抗孵育时间、最佳酶标抗体孵育时间及最佳底物显色时间分别为1. 5h、 2h、I. 5h、lh、lOmin，如表 14 至表 19 所示。
[0152] 表14最适McAb包被浓度和H3N2CIV尿囊液最佳工作浓度ELISA试验结果
[0153]
[0154] 表15兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度试验结果*
[0155]
[0156] *各孔相对应空白对照组试验结果如表16
[0157] 表16兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体工作浓度空白对照组试验结果
[0158]
[0160] 表17最适封闭液的确定
[0161]
[0162] 表18各步反应最佳作用时间的确定
[0163]
[0164] 表19 TMB底物显色时间的确定
[0165]
[0167] 四、双抗体夹心ELISA检测方法阴阳性判定标准的确定
[0168] 用上述已建好的双抗夹心ELISA方法检测16份10日龄SPF鸡胚尿囊液。以最佳 稀释倍数H3N2CIV尿囊液作阳性对照。计算阴性样本OD 45tol平均值（X)及其标准差（SD)， 根据统计学原理，求得阴阳性界限（X+3SD)。即，当OD45cJ直彡（X+3SD)时，样品可在99.9% 的可信度上判断为阳性，当（X+3SD)多OD 45tlmiS (X+2SD)时判为可疑，需再次检测或结合其 他更灵敏的方法检测；当OD45tolS (X+2SD)时，则判为阴性。
[0169] 结果表明：在上述最优条件下，用16份SPF阴性鸡胚尿囊液进行ELISA检测，平 均OD 45tllJI X为〇. 131，SD为0. 032,得到阳性临界值为（X+3SD) = 0. 228,阴性临界值为 (X+2SD) =0. 195。即，当样品OD45to^ 0.228时，可以在99. 9%的可信度上判断为阳性；当 样品0· 228彡OD45tlnm彡0· 195时判为可疑；当样品OD 45Qnm< 0· 195时，则判为阴性（图7)。
[0170] 实施例4双抗夹心ELISA方法敏感性试验
[0171] 在最佳反应条件下，将 H3N2CIV 尿囊液以 1 :2°、1 :2\1 :22、1 :23、1 :24、1 :25、1 :26、 1 :27、1 :28、1 :29、1 :21(1、1 :2n、l :212、1 :213、1 :214、1 :215倍比稀释后，采用实施例 3 建立的双 抗夹心ELISA和HA试验同时测定其效价，确定病毒尿囊液最大稀释倍数，比较这两种方法 检测H3N2CIV的敏感性。
[0172] 采用双抗夹心ELISA方法测定H3N2CIV尿囊液不同稀释度的OD45tol值，当OD 45tlmi值 彡0. 228即判为阳性。H3N2CIV尿囊液不同稀释度ELISA效价，如图8所示，该H3N2CIV尿 囊液的ELISA效价为1 :128。经血凝试验测定，该H3N2CIV尿囊液HAU为1 :32。本实验构 建的双抗夹心ELISA方法的检测灵敏度是HA方法的8倍。
[0173] 实施例5双抗夹心ELISA方法特异性试验
[0174] 在最佳反应条件下，以 CDV、CPV、CPIV、CAV- II、CRV 以及 H7N9、H10N8、H9N2、H3N8 亚型流感病毒为待检样品。以H3N2CIV尿囊液为阳性对照，确定本方法的特异性。
[0175] 以0^、〇卩￥、〇卩1￥、〇六￥-11、0^以及!17_、!11(^8、!19吧、!13胳亚型流感病毒为待 检样品进行双抗夹心ELISA检测。结果显示H3N8亚型EIV OD45tol值大于临界值，为0. 298， HAU相应为24。其它被检病原OD45tlmi值均小于临界值，其中，H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病 毒HAU相应分别为为2 6、26、26。表明本研宄建立的ELISA方法对H3N8亚型EIV有较弱的交 叉反应，而对犬常见呼吸道病毒及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒无交叉反应性（图9)。
[0176] 实施例6双抗夹心ELISA方法重复性试验
[0177] 取3块不同批次包被的酶标板，用双抗夹心ELISA方法检测4份己知HAU的 H3N2CIV尿囊液样品。在同一块酶标板上进行批内重复，每份样品重复5孔。不同酶标板之 间进行批间重复。根据测定的OD45tol值，计算其变异系数（CV)，CV = SD/XX 100%。如果 变异系数〈10%，则说明其重复性和稳定性好。
[0178] 结果表明：4份鸡胚尿囊液OD45tol值批内变异系数在2. 40%~6. 56%之间，批间 变异系数在3. 82 %~7. 28 %之间，均小于10 %，具有良好的重复性（表20)。
[0179] 表20双抗夹心ELISA重复性试验（η = 4)
[0180]
[0181] 实施例7双抗夹心ELISA方法临床样本检测
[0182] 采用建立的双抗夹心ELISA方法对346份本实验室所收集的犬鼻拭子进行检测， 发现阳性样品8份，检出率为2. 31%。而采用鸡胚分离病毒仅检出1份阳性样品，检出率为 0. 29%。两种方法阳性符合率为12. 5%，阴性符合率为100%，总符合率为98% (表21)。
[0183] 表21犬鼻拭子临床样品检测结果
【主权项】
1. 一种H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述细胞株于 2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCC201555。2. 权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌得到的单克隆抗体。3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG2a亚型，轻 链为￡3/7/73链。4. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应 用。5. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物 中的应用。6. 权利要求2所述单克隆抗体在检测流感病毒中的应用。7. 根据权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为犬流感病毒。8. 基于权利要求2所述单克隆抗体的免疫检测方法。
【专利摘要】本发明涉及细胞工程技术领域，公开了一种H3N2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用。所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555；其分泌的单克隆抗体与H3N2亚型犬流感病毒血凝素特异性结合，亲和力高，纯化后效价为1：320,000，它与CDV、CPV、CPIV、CAV-Ⅱ、CRV及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒均不发生反应。通过注射本发明所述单克隆抗体用于预防和控制流感病毒的感染，与传统的疫苗接种手段相比，特异性更强，风险更低，安全性更高。具有实际的应用价值。CCTCC C20155520150513
【IPC分类】G01N33/577, C12R1/91, A61P31/16, C07K16/10, C12N5/20, A61K39/42, G01N33/569
【公开号】CN104911150
【申请号】CN201510279054
【发明人】李守军, 李陆涛, 袁子国, 孙凌霜, 贾坤, 远立国, 卢刚, 涂黎晴
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月27日